Primär endodermalt epitelceller Culture från gulesäcken membran av japansk vaktel embryon
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Vi etablerade ett endodermalt epitel cellodlingsmodell (EEG) för att studera funktionen hos vissa enzymer och proteiner i medla näringsutnyttjande av fågelembryon under utveckling. Befruktade japanska vakte inkuberades vid 37 ° C under 5 dagar och sedan gulesäcken membran (YSM) uppsamlades för att fastställa EEG odlingssystemet. Vi isolerade den embryonala endodermet skiktet från YSM, och skivade membranet in 2 – 3 mm bitar och digererades partiellt med kollagenas före ympning i 24-brunnars odlingsplattor. EECS prolifererar ut ur vävnaden och är redo för cellodlingsstudier. Vi fann att EECS hade typiska kännetecknen för YSM in vivo, till exempel ackumulering av lipid droppar, uttryck av sterol O-acyltransferas och lipoproteinlipas. Den partiella uppslutning behandlingen signifikant ökad framgångsrik graden av EEG kultur. Med hjälp av den EECS visade vi att uttrycket av SOAT1 reglerades av cAMP dependent proteinkinas A relaterad reaktionsvägen. Denna primära japansk vaktel EEG odlingssystemet är ett användbart verktyg för att studera embryonala lipid transport och klargöra vilken roll gener som är involverade i förmedling näringsutnyttjande i YSM under fågel embryonal utveckling.
Introduction
Den största närings resurs aviär embryot är äggula, som består av 33% lipider, 17% protein och 1% aska. 1 under fosterutvecklingen, gulesäcken membran (YSM) växer inifrån embryonala bukhålan och gradvis täcker äggula yta. Med början vid embryonal dag 2, genuttryck i samband med lipidmetabolism och angiogenes successivt ökat i YSM och YSM utvecklas långsamt villus liknande utsprång. 8,9 Dessa prognoser ökar absorptionen av äggula näringsämnen för att stödja embryonal utveckling. Den YSM är en extraembryonic vävnad som innehåller tre groddblad, endoderm, mesoderm och ektoderm. 14 gulesäcken ektoderm ansikten äggvitan och länkar med vitellinmembranet att försiktigt täcka gulesäcken. De endodermala epitelceller står inför direkt mot äggula och fungera som näringsutnyttjande portaler. 6 Som YSM expanderar endodermalt epitelceller (EECS) kan delas med shape och funktionalitet i två grupper, område vitelline och området vasculosa. 7
Område vitelline består av endodermala celler och är avlägsen från embryot; område vasculosa består av mesodermala celler och omfattar differentierade eec med blodkärl och bindväv. Genom embryonala dag 5, är äggulan helt täckt av ektoderm och endoderm av YSM och kärlområdet har vuxit snabbt. Den YSM absorberar, omdisponeras och frigör lipider (som äggula härrörande mycket låg densitet lipoprotein) och proteiner i den embryonala cirkulationssystemet. 9, 2 Därför har vi etablerat en primär japansk vaktel embryonala endodermalt epitelial cellkultursystem, för att studera mekanismerna för lipid utnyttjande i YSM under fågel embryonal utveckling.
Lipider såsom triacylglycerol, lecitin, fosfolipider och kolesterolester (CE) är de primära energikällor för fågelembryon. På de tidiga stadierna av utveckling, äggula lipider är composed endast 1,3% CE och det stiger till 10-15% efter halva tiden av avian embryonal utveckling 3, är 11. Kolesterol ester syntetiseras från kolesterol av sterol O-acyltransferas en (SOAT1) i fågelembryo YSM. 4
Lagringsformen av kolesterol är CE är CE transporteras i lipoproteiner och lipoproteiner transporteras genom cirkulationen till vävnaderna. 13 En vecka före lucka finns snabba tillväxten av fågelembryon. Cirka 68% av de återstående fettinnehållet i äggula absorberas under detta skede. 10 Den mekanism genom vilken äggula lipider används kan klargöras genom ett EEG forskningsmodell. En kyckling EEG odlingsprotokoll bildades för att uppnå denna forskning mål. 2, 9 Men på grund av den låga andelen framgångsrika vävnadsexplantat, ett förbättrat EEG cellodlingsförfarande behövs för att studera funktionen av vissa enzymer och proteiner vid medienäringsutnyttjande genom fågelembryon under utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eftersom den tidigare odlingssystemet har endast begränsad framgång, behövs ett bättre kultursystem. Den japanska vaktel YSM endoderm kräver behandling med proteolytiska enzymer såsom kollagenas att lossa cellcellkontakter för att uppnå bättre tillväxt i ex-vivo explantat. Våra data visar att cellantal från partiell digestion behandling var större än från osmält vävnadsodling efter sådd under 2 dagar (Figur 1). Därför är den partiella proteolytisk digestion ett kritiskt steg för at…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Medel för utveckling av nuvarande protokollet är särskilt stöds av "sikta mot toppen University Plan" av National Taiwan University, Taiwan (bidrag ID-104R350144), samt ministeriet för vetenskap och teknik i Taiwan (bidrag ID: MOST 104 -2313-B-002-039-My3). Vi tackar särskilt Center for Biotechnology av National Taiwan University för att ge ett djur rum och laboratorielokaler för den aktuella studien.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
