Isolement de CD 90+ fibroblastes / myofibroblastes de spécimens humains congelés gastro-intestinaux

Résumé

Ici, un protocole permettant d’isoler et d’établir des cultures primaires de fibroblastes/myofibroblastes (MF) à partir de cellules congelées produisant du tissu gastrique, de l’intestin grêle et du côlon avec un phénotype MF est présenté. Ces cellules expriment CD90, α-SMA et vimentine. Les MF peuvent être utilisés pour une variété de tests fonctionnels, y compris l’activité enzymatique et la production de cytokines.

Résumé

Fibroblastes / myofibroblastes (PDE) ont gagné une attention croissante pour leur rôle dans la pathogenèse et leurs contributions à la fois la cicatrisation des plaies et la promotion du microenvironnement de la tumeur. Bien qu'il existe actuellement de nombreuses techniques pour l'isolement de la MFS de (GI) tissus gastro-intestinaux, ce protocole introduit un élément original de l'isolement de ces cellules stromales de tissu congelé. La congélation des échantillons de tissus de GI non seulement permet au chercheur d'acquérir des échantillons de collaborateurs à travers le monde, les biobanques et les fournisseurs commerciaux, il permet également le traitement retardé d'échantillons frais. Le protocole décrit va toujours produire des cellules fusiformes avec le phénotype caractéristique MF qui expriment les marqueurs CD90, α-SMA et la vimentine. Comme ces cellules sont dérivées à partir d'échantillons de patients, l'utilisation de cellules primaires confère également le bénéfice de la MFS imitant de près depuis des états pathologiques, à savoir le cancer et les maladies inflammatoires de l'intestin. Cette technique a l'abeillen validée dans l'estomac, l'intestin grêle et du côlon MF génération de culture primaire. MF cultures primaires peuvent être utilisés dans une vaste gamme d'expériences sur un certain nombre de passage et leur pureté évaluées à la fois par immunocytochimie et cytométrie de flux.

Introduction

Myofibroblastes / fibroblastes (PDE) représentent une population abondante de cellules dans gastro-intestinal (GI) muqueuse. Ces cellules stromales sont situés juste en dessous de l'épithélium et forment un réseau interconnecté à l'intérieur de la muqueuse de la lamina propria dans l'intestin. MF ne sont pas seulement responsables pour le dépôt de la matrice extracellulaire, mais par la réglementation paracrine peut influencer le transport de l'électrolyte, la restitution et la fonction de barrière de l'épithélium adjacente ^{1, 2.} En outre, la MFS ont été montré à jouer un rôle clé dans l'inflammation et les tissus remodelage ^3,....

Protocole

Le protocole pour l'obtention de tissus humains jetés de patients chirurgicaux et la mise en place de cultures primaires a été approuvé par l'Université du Texas Medical Branch et de l'Université du Nouveau-Mexique Institutional Review Board. Les exigences générales pour l'obtention d'échantillons de tissus humains est décrite ci-dessous. Notez que depuis MFS peut être isolé à partir de tissus congelés, les biobanques et de fournisseurs commerciaux sont également des options viables.

1. Obtenir tissus humains

1. Proposez un protocole pour obtenir des tissus du côlon humain à la commission d'examen instituti....

Résultats

En utilisant ce protocole de digestion enzymatique, nous avons toujours été en mesure d'isoler et de cultiver CD90 ⁺ cellules stromales de la muqueuse intestinale MF population de GI spécimens et des biopsies (Figure 1) chirurgicales. Visible colonie prolifération MF a pu être observée le jour 2 - 5 après le semis suspensions cellulaires mononucléaires dans des plaques de 6 puits (figure 1A-B). Les cultures primaires MF atteignent ~ 50 - 7.......

Discussion

Bien que ce protocole a été développé pour l'application de recherche uniquement, à la lumière de l'importance croissante critique de cellules stromales comme un cancer potentiels biomarqueurs pronostiques et cible thérapeutique, la capacité de geler biospécimens «fonctionnelles» pour une utilisation ultérieure offre un avantage significatif. Cela représente un avantage unique pour la création de banques de tissus biologiques cliniques, qui peuvent servir d'outils supplémentaires servant à faire progresser l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MEM, 1x	Corning	MT-10-010-CV
Solution saline équilibrée de Hanks	Sigma-Aldrich	H6648
Pyruvate de sodium	Sigma-Aldrich	S8636
Antibiotique-antimycosique, 100x	Gibco	15240-062
Ciprofloxacine HCl	Corning	61-277-RF
L-Glutamine, 100x	Corning	25-005-CI
MEM Acides aminés non essentiels	Corning	25-025-CI
Diméthylsulfoxyde (DMSO) Hybri-Max	Sigma-Aldrich	D2650
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma-Aldrich	646563
0,5 M EDTA, pH 8,0	Cellgro	46-034-CI
DNAse	Worthington	LS002139
Collagénase de  ; Clostridium histolyticum, Type I	Sigma-Aldrich	C1639
Collagénase de  ; Clostridium histolyticum, Type II	Sigma-Aldrich	C1764
Collagénase de Clostridium histolyticum, Type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Solution de dissociation cellulaire Accumax	Sigma-Aldrich	A7089
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleDissociateur MACS	Miltenyi Biotec	130-093-235
Compteur de cellules automatisé Countess	Invitrogen	C10227
Filtre de cellules (70 µ ; m)	Corning	352350
PE Souris Anti-Humain Vimentin	BD Biosciences	562337	Clone RV202
FITC Monoclonal Anti-Actine, &alpha ;-Muscle Lisse	Sigma-Aldrich	F3777	Clone 1A4
APC Souris Anti-Humain CD90	BD Biosciences	559869	Clone 5E10