בידוד של פיברובלסטים / myofibroblasts 90 + CD מאדם דוגמאות במערכת העיכול קפוא
Summary
Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.
Abstract
Fibroblasts / myofibroblasts (MFS) כבר צובר תשומת לב הולכת וגובר לתפקידם בפתוגנזה ותרומתם לשני ריפוי הפצע והקידום של מייקרו-הסביבה של הגידול. אמנם יש כיום טכניקות רבות לבידוד של MFS מרקמות של מערכת העיכול (GI), פרוטוקול זה מציג אלמנט רומן של בידוד של תאי סטרומה אלה מהרקמה קפוא. הקפאת דגימות רקמה במערכת העיכול לא רק מאפשרת לחוקר לרכוש דגימות ממשתפי פעולה ברחבי העולם, biobanks, וספקים מסחריים, זה גם מאפשר עיבוד המאוחר של דגימות טריות. הפרוטוקול המתואר באופן עקבי יניב תאים דמויי כישור אופייניים עם פנוטיפ MF המבטא את הסמנים CD90, α-SMA וvimentin. כאשר התאים אלה נגזרים מדגימות מטופל, השימוש בתאים ראשוניים גם מקנים היתרון של MFS מחקה באופן הדוק ממדינות-כלומר מחלה סרטן ומחלות מעי דלקתיות. טכניקה זו יש דבורהn תוקף בקיבה, מעי דק, ודור התרבות העיקרית הגס MF. תרבויות MF עיקריות ניתן להשתמש במגוון רחב של ניסויים על פני מספר המעבר וטוהר שלהם הוערכו על ידי שני immunocytochemistry וcytometry זרימת הניתוח.
Introduction
Myofibroblasts / fibroblasts (MFS) מייצג אוכלוסיית שפע של תאים במערכת עיכול רירית (GI). תאי סטרומה אלה ממוקמים ממש מתחת האפיתל ויוצרים רשת ביניהם בתוך propria lamina הרירי במעיים. MFS הוא לא רק אחראי על התצהיר של מטריקס, אבל באמצעות רגולציה אוטוקריני עשויים להשפיע תחבורת אלקטרוליט, השבת, ותפקוד מחסום של האפיתל הסמוך 1, 2. יתר על כן, MFS הוכח לשחק תפקיד מפתח בדלקת ורקמה שיפוץ 3, 4. myofibroblasts הוא חלק קריטי של מייקרו-הסביבה של הגידול, שבו הם ידועים גם בשם fibroblasts הסרטן הקשורים, ולתרום לצמיחת התאים הסרטני ולשמש כנישה לתאי גזע סרטני 3. נתונים חדשים מצביעים על כך שMFS יכול גם לשמש תאי הצגת אנטיגן מקומיים. בנוסף, פונקצית MFS רגולטורים חשובים של תגובה חיסונית מולדת ובעלי כושר הסתגלות, producing מגוון של ציטוקינים וגורמי גדילה 5.
באנשים בריאים, הם האמינו תאי MFS להבדיל מתאי גזע mesenchymal ולהביע על פני השטח שלהם התא, סמן mesenchymal, 3 CD90, 5. תאים אלה הם גם חיוביים עבור vimentin, אבל שלילי לאפיתל וסמן תא דם, EpCAM וCD45 , בהתאמה. Myofibroblasts הם הציעו להיות צורה פעילה של fibroblasts וניתן להבחין בין fibroblasts מופעל לא על ידי הביטוי של α-SMA 5.
במהלך העשור האחרון, גישות רבות לבידוד של myofibroblasts מרירית מעי הגס אנושית פורסמו-מבוססת בעיקר על השיטה המתוארת במקור על ידי et al Mahida. 5-8. בעוד שמחקרים בודדים לדווח נהלי בידוד מרירית מעי שונים, אין פרוטוקול אוניוורסלי לבידוד של MFS מאזורים מרובים של מערכת העיכול (כלומר, קיבה, קטן וlרירית מעי arge) כבר פורסמה. הפרוטוקול שהוצג במסמך זה נבדק ומשמש בהצלחה לכל שלושת הסוג של רקמה שהוזכר לעיל. . יתר על כן, נהלים לבידוד MFS מרירית מערכת העיכול קפוא לא דווחו.
כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת, המבוססת על עיכול אנזימטי, ובמקביל מאפשר לבידודה של רירית מעי אדם MFS לתרבות וcytometry זרימת הניתוח בתא בודד, הכנות טריות מתעכלים, רירית. טכניקה זו באופן מהימן מניבה תרבויות עיקריות עם פנוטיפ MF. יתר על כן, ניתן להשתמש באותן השיטות כדי לבודד MFS מדגימות קפואות של רקמות מעי קיבה וקטנות גם כן. בידוד של myofibroblasts מרקמת GI טרי כבר תואר לעיל; עם זאת, השימוש בדגימות קפואות מציג יתרונות רבים. כלומר, חוקרים יוכלו לאסוף ורקמות חנות מכל מספר של משתפי פעולה ברחבי העולם שיש להם capability ספינה דגימות רקמה קפוא. יתר על כן, חוקרים עשויים למצוא את האוסף של רקמות שהושלכו מחדר הניתוח ו / או צמוד אנדוסקופיה והמיידי עיבוד הרקמות לבידוד לסכסוך עם לוח הזמנים של הניסויים הנוכחיים שלהם. כמו כן, בשל האופי הבלתי צפוי של ניתוח, רכש רקמה עלול להתרחש מאוחר מאוד ביום, אשר יגביל את הזמן שנותר לרקמת עיבוד. הקפאת רקמה לעיבוד מאוחר יותר יהיה לשפר באתגרים אלה.
לבסוף, שיטות אלה כבר נוצלו בהצלחה בבידוד של myofibroblasts מעי הגס, קיבה וקטנה במצבי מחלה כגון קרצינומה של המעי הגס ומחלות מעי דלקתיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד פרוטוקול זה פותח ליישום המחקר בלבד, לאור גדל חשיבות קריטית של תאי סטרומה כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים סרטן פרוגנוסטיים ויעד טיפולי, היכולת להקפיא biospecimens "פונקציונלי" לשימוש מאוחר יותר מציעה יתרון משמעותי. זה מייצג יתרון ייחודי ליצירת biorepository הקליני, העשוי…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).
Materials
| MEM, 1X | Corning | MT-10-010-CV | |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | |
| Ciprofloxacin HCl | Corning | 61-277-RF | |
| L-Glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Cellgro | 46-034-CI | |
| DNAse | Worthington | LS002139 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type I | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type II | Sigma-Aldrich | C1764 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Accumax cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | A7089 | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Cell Strainer (70µm) | Corning | 352350 | |
| PE Mouse Anti-Human Vimentin | BD Biosciences | 562337 | Clone RV202 |
| FITC Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich | F3777 | Clone 1A4 |
| APC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 559869 | Clone 5E10 |
References
- Yamaguchi, H. et al. Stromal Fibroblasts Mediate Extracellular Matrix Remodeling and Invasion of Scirrhous Gastric Carcinoma Cells. PLoS ONE. 9, e85485 (2014).
- Mullan, N., Hughes, K. R., & Mahida, Y. R. Primary Human Colonic Myofibroblasts Are Resistant to Clostridium difficile Toxin A-Induced, but Not Toxin B-Induced, Cell Death. Infect Immun. 79, 1623-1630 (2011).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., & Mifflin, R. C. Mesenchymal Cells of the Intestinal Lamina Propria. Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).
- Latella, G., Sferra, R., Speca, S., Vetuschi, A., & Gaudio, E. Can we prevent, reduce or reverse intestinal fibrosis in IBD? Eur Rev Med Pharmacol Sci. 17, 1283-1304 (2013).
- Saada, J. I. et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Mahida, Y. R. et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am J Physiol. 273, G1341-1348 (1997).
- Roncoroni, L. et al. Isolation and culture of fibroblasts from endoscopic duodenal biopsies of celiac patients. J Transl Med. 7, 40 (2009).
- Pinchuk, I. V. et al. Stromal Cells Induce Th17 during Helicobacter pylori. Infection and in the Gastric Tumor Microenvironment. PLoS ONE. 8, e53798 (2013).
- Pinchuk, I. V. et al. Monocyte chemoattractant protein-1 production by intestinal myofibroblasts in response to staphylococcal enterotoxin a: relevance to staphylococcal enterotoxigenic disease. J. Immunol. 178, 8097-8106 (2007).
- Paulsson, J., & Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Sem Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Valcz, G., Sipos, F., Tulassay, Z., Molnar, B., & Yagi, Y. Importance of carcinoma-associated fibroblast-derived proteins in clinical oncology. J. Clin. Pathol. 67, 1026-1031 (2014).
- Minonzio, G. et al.Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69, 211-216 (2014).
- Gargus, M., Niu, C., & Shaker, A. Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus. J. Vis. Exp. (95), e52215. (2015).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., & Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. J. Vis. Exp. (80), e50611. (2013).
- Schiller, J. H., & Bittner, G. Loss of the Tumorigenic Phenotype with in Vitro, but not in Vivo, Passaging of a Novel Series of Human Bronchial Epithelial Cell Lines: Possible Role of an α5/β1-Integrin-Fibronectin Interaction. Cancer Res. 55, 6215-6221 (1995).
- Augello, A., Kurth, T. B., & De Bari, C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. Eur Cell Mater. 20, 121-133 (2010).
- Meller, D., Pires, R. T. F., & Tseng, S. C. G. Ex vivo preservation and expansion of human limbal epithelial stem cells on amniotic membrane cultures. Br J Ophthalmol. 86, 463-471 (2002).
- Kuhlmann, I. The prophylactic use of antibiotics in cell culture. Cytotechnology. 19, 95-105 (1995).
- Morris, K. T., Nofchissey, R. A., Pinchuk, I. V., & Beswick, E. J. Chronic Macrophage Migration Inhibitory Factor Exposure Induces Mesenchymal Epithelial Transition and Promotes Gastric and Colon Cancers. PLoS ONE. 9, e98656 (2014).
