Transcriptome profilage des<em> In-Vivo</em> embryons de bovins pré-implantation à l'aide de deux couleurs Microarray Plate-forme
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
Perte embryonnaire précoce chez les vaches laitières à forte production est l' un des principaux défis dans l'industrie laitière 1, 2. Bovine est devenu un modèle intéressant pour étudier le développement préimplantatoire d'embryons humains en raison de leur processus similaire de développement 3, 4. Cependant, plus de recherche est nécessaire pour avoir une meilleure compréhension des gènes impliqués dans le développement embryonnaire précoce bovine.
Après vingt ans depuis la première technologie de microréseau développé en 1995 5, le développement des plus sophistiqués technologie sonde de fabrication réduit les erreurs d'impression et de la variabilité des puces de réseau au sein et entre les différentes plates – formes de biopuces 6. La technologie des microréseaux améliorée a donné lieu à une large application de cette technologie dans la recherche clinique 7 et , plus récemment, au début de l' embryon qévaluation de la ualité 8.
La grande quantité de matériel nécessaire à la technologie des microréseaux est la principale raison pour laquelle la technologie des microréseaux d'abord échoué à entrer dans un certain nombre de domaines de recherche tels que le développement embryonnaire précoce. Plus récemment, des procédés d'amplification de l' ARN ont été améliorés pour amplifier de façon linéaire jusqu'à l' ARN microgrammes niveau de la sous-nanogramme matériau de départ d'ARN 9. Il existe plusieurs trousses d'amplification d'ARN disponibles dans le commerce sur le marché; cependant, les kits les plus populaires bien développés sont liés à Ribo-Single Primer Isotherme Amplification 10 et promoteur T7 entraînés 11 méthodes. L'amplification de l' ARN anti – sens le plus populaire utilise la transcription in vitro avec une amorce oligo dT liant à un promoteur T7 à l' extrémité 5 '12. Cette technologie permet le maintien de la plupart des transcriptions anti-sens représentatifs après amplification linéaire fou des réseaux d' hybridation 13. Cette méthode a été adaptée pour amplifier le niveau picogramme de l' ARN total extrait de bovin embryon 8.
Système d' attelage universel (ULS) est la méthode de marquage qui intègre directement l'ADN ou de l' ARN amplifié par un colorant fluorescent platine lié soit Cyanine 547 ou Cyanine 647, en formant une liaison de coordination sur la position N7 de la guanine 14. Cette méthode a été adaptée dans la recherche sur les embryons pour générer plus stable amplifié ARNa sans modification par rapport à la aminoallyl modifié ARNa généré par la méthode enzymatique 15. méthodes Les deux colorants unique et d'étiquetage des deux colorants ont été adaptés à l'aide système d'attelage universel dans microarray. Une vaste étude de comparaisons de puces à ADN était qu'il existe une bonne corrélation entre la qualité des données entre les plates – formes de réseau d' une ou deux couleurs 6.
Récemment, à la fois promoteur T7 entraînementméthodes n ARN antisens d'amplification et de marquage ULS ont été développés pour fournir un protocole plus fiable pour générer une quantité suffisante de haute qualité marqué matériaux Arna pour microarray hybridation 8, 16. Par conséquent, cette étude fournit un protocole pour démontrer certaines des étapes importantes de l'extraction de l'ARN à l'analyse des données impliquées dans deux couleurs microréseaux utilisant Jour 7 embryons de bovins, par exemple.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le premier problème à effectuer l'analyse des microréseaux utilisant Jour 7 embryons de bovins est de ne pas obtenir des quantités suffisantes d'ARN de haute qualité pour l'étude de l'expression des gènes. extraction de l'ARN phénol traditionnel / chloroforme et la méthode de précipitation à l'éthanol ne sont pas recommandés pour Jour 7 embryons, ce qui entraîne un faible rendement et possible phénol restes inhiber la réaction d'amplification d'ARN. Au lieu de cela, une m?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
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