Transcriptoma de perfiles de<em> In-Vivo</em> Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
La pérdida embrionaria temprana en vacas lecheras de alta producción es uno de los principales retos en la industria láctea 1, 2. Bovina se ha convertido en un modelo interesante para estudiar el desarrollo de preimplantación de embriones humanos debido a su proceso de desarrollo similares 3, 4. Sin embargo, se requiere más investigación para tener una mejor comprensión acerca de los genes implicados en el desarrollo embrionario temprano bovina.
Después de veinte años desde la primera tecnología de microarrays desarrollaron en 1995 5, el desarrollo de más sofisticada tecnología de sonda de fabricación reducidos errores de impresión y la variabilidad de los chips de matriz dentro y entre las diferentes plataformas de microarrays 6. La tecnología de microarrays mejorada dio como resultado una amplia aplicación de esta tecnología en la investigación clínica 7 y, más recientemente, en embrión temprano qevaluación uality 8.
La gran cantidad de material necesario para la tecnología de microarrays es la razón principal por la que la tecnología de microarrays inicialmente no introduzca un número de campos de investigación tales como el desarrollo embrionario temprano. Más recientemente, los métodos de amplificación de ARN se han mejorado para amplificar linealmente ARN hasta el nivel de microgramos de sub-nanogramos material de partida 9 ARN. Hay varios kits de amplificación de ARN comerciales disponibles en el mercado; sin embargo, las más populares kits bien desarrollados están relacionados con Ribo-cebador único amplificación isotérmica 10 y 11 impulsadas promotor T7 métodos. El más popular de amplificación del ARN antisentido utiliza la transcripción in vitro con un cebador oligo dT que une a un promotor de T7 en el extremo 5 12. Esta tecnología permite mantener la mayor parte de las transcripciones antisentido representativas después de la amplificación lineal fo matrices de hibridación 13. Este método ha sido adaptado para amplificar el nivel de picogramos de ARN total extraído de embriones bovinos 8.
Sistema de elevador universal (ULS) es el método de marcaje que incorpora directamente el ADN o ARN amplificado con colorante fluorescente de platino ligado ya sea Cyanine 547 o Cyanine 647, formando un enlace de coordinación en la posición N7 de la guanina 14. Este método fue adaptado en la investigación de embriones para generar más estable amplificada Arna sin modificaciones en comparación con el aminoallyl modificó Arna generado por el método enzimático 15. Ambos métodos único colorante y etiquetado dos colorantes se han adaptado utilizando Sistema de Enlace Universal de microarrays. Un amplio estudio de microarrays comparaciones fue que existe una buena correlación entre la calidad de datos entre las plataformas de gama de uno y de dos colores 6.
Recientemente, tanto en coche T7 promotormétodos n RNA antisentido de amplificación y etiquetado ULS se han desarrollado para proporcionar un protocolo más fiable para generar una cantidad suficiente de materiales de alta calidad marcado ARNa para microarrays de hibridación 8, 16. Por lo tanto, este estudio proporciona un protocolo para demostrar algunas de las etapas importantes de la extracción de ARN para el análisis de datos de microarrays involucrado en dos colores usando Día 7 embriones bovinos como un ejemplo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El primer problema para llevar a cabo el análisis de microarrays utilizando Día 7 embriones bovinos no está recibiendo cantidades suficientes de ARN de alta calidad para el estudio de la expresión génica. Tradicional fenol / cloroformo extracción de RNA y método de precipitación con etanol, no se recomienda para el día 7 embriones, lo que resulta en un bajo rendimiento y la posible inhibición de fenol restos de reacción de amplificación de ARN. En lugar de ello, un método basado en la columna estándar es m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
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