In vivo אלקליין השביט Assay ואנזים-modified אלקליין השביט Assay עבור מדידת Breaks Strand דנ"א נזק חמצוני דנ"א עכברוש הכבד
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
את assay השביט אלקליין מודד הפסקות גדיל DNA ברמה מתא בודד. המתלים של תאים בודדים המוטבעים agarose על שקופיות מיקרוסקופ והתאים lysed כדי ליצור nucleoids, אשר מכילים לולאות supercoiled של DNA. אלקטרופורזה ב- pH> 13 תוצאות בהפסד של supercoiling בלולאות DNA המכילות הפסקות גדיל, עם הגדילים המשוחררים של DNA נודדים לעבר האנודה, יצירת מבנים דמוי שביט שיכול להיות שנצפו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. DNA המקוטעת נודדת "הראש" של השביט לתוך "הזנב" בהתבסס על הגודל של השבר, ואת הקרינה היחסית של זנב השביט לעומת העוצמת הכוללת (ראש וזנב) ניתן להשתמש כדי לכמת DNA שבירת 1 , 2. Assay הוא פשוט, רגיש, צדדי, מהיר, וזול יחסית 1. הגילוי של הדנ"א מקוטעת הנגרמת על ידי סוכני נזק-DNA משמש ב assay לכימות נזק לדנ"א בתאים או מבודד גרעינים indiviרקמות כפולות של חיות שטופלו בחומר genotoxic פוטנציאלי (ים). בשל יתרונותיה, assay השביט in vivo מומלץ בתור assay עקה גנטוקסית השני in vivo (לזווג עם assay הגרעינון in vivo) לביצוע הערכות בטיחות המוצר בכנס הבינלאומי הנוכחי על Harmonisation (ICH) 3 רשות המזון האירופית לבטיחות (EFSA 4) והנחיות רגולטוריות. במעבדה שלנו, יש לנו עובדים את assay להערכת נזק DNA vivo המושרה על ידי מרכיבי מזון, תרופות, ועל ננו 5-10. כבד עכברוש ישמש כדוגמא בפרוטוקול זה, אבל assay השביט יכול להתבצע עם רקמות / איברים אחרים של חיות ניסוי, כל עוד תאי בודדים שלמים יכול להיות מבודד מן הרקמה.
סוגים מסוימים של ניזק לדנ"א קשים לזהות כמו הפסקות גדיל DNA ללא שינוי assay שביט אלקליין הבסיסי. במקרה של נזק לדנ"א חמצוני, ב גדילreaks ניתן ליצור על נגעים חמצוני ב- DNA על ידי לעכל עם אנזימים לתיקון כגון 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase 1 אדם (hOGG1, אשר יוצרת הפסקות 8-oxoguanine (8-oxoGua) ו מתיל-fapy-גואנין 11. כמו כן, Endonuclease III (Endo III) יוצרת הפסקות בעיקר פירימידין חמצון 1. לפיכך, תוספת של צעד אנזים עיכול הופך את assay שיטה ספציפית ורגישה למדידת נזק לדנ"א חמצוני in vivo 12. ניצול מבחני אלה, שהראנו toxicant הנגרמת חימצון ל- DNA נזק בכבד של חולדות ועכברים 6-8 ו בלב חולדות 10.
את assay שביט אלקליין יש יישומים רבים טוקסיקולוגיה גנטי מסוים מופעל אדם: 1) כמו מעקב assay vivo עבור genotoxins המזוהה על ידי רגיש במבחנת בדיקות 3,13, 2) להעריך מנגנונים של ניזק לדנ"א xenobiotic הנגרמת ברקמות מרובות 14, 3) לחקור אםקרצינוגן פועלת באמצעות genotoxic או מצב שאינו genotoxic הפעולה (MOA) 7, 4) כדי להעריך תיקון DNA נזק 15, 5) לחקור מחלות אנושיות וחשיפה תעסוקתית 16, ו -6) כמו assay הקרנת תפוקה גבוהה פוטנציאל איבר ספציפי עקה גנטוקסית 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את המדידה במקביל של שני ניזק לדנ"א ישיר חמצוני בכבד חולדה ברמת התא הבודדה. הפרוטוקול הכללי חל על כל רקמה שממנו תאים או גרעינים יחידים יכולים להיות מבודדים עם ניזק לדנ"א נגרם עיבוד מינימאלי (כלומר, ניזק לדנ"א מושרה ולא על ידי סוכן הבדיקה, אל…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
References
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the ‘comet’ assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
- Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379 (2011).
- Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
- Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
- Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
- Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
- Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
- Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
- Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
- Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
- Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
- Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
- Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
- AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013)
- Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice–part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
- Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
- Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , (2000).
- Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
- Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).
