En Vivo alcalina Comet Assay y Comet Assay alcalina modificada con enzimas para la medición de roturas en el ADN Strand y daño oxidativo del ADN en el hígado de rata
Summary
The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.
Abstract
Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.
Introduction
El ensayo cometa alcalino mide roturas de la cadena de ADN a nivel de una sola célula. Las suspensiones de células individuales están incrustadas en agarosa sobre un portaobjetos de microscopio y las células se lisaron para formar nucleoides, que contienen bucles superenrollado de ADN. Electroforesis a pH> 13 resultados en la pérdida de superenrollamiento en los bucles de ADN que contienen roturas de la cadena, con las hebras de ADN liberados que migran hacia el ánodo, creando estructuras parecidas a cometas que pueden ser observadas por microscopía de fluorescencia. La fragmentación de ADN migra de la "cabeza" del cometa en la "cola" en función del tamaño del fragmento, y la fluorescencia relativa de la cola del cometa en comparación con la intensidad total (cabeza y cola) se puede utilizar para cuantificar la rotura de ADN 1 , 2. El ensayo es simple, sensible, versátil, rápido, y relativamente barato 1. La detección de ADN fragmentado causada por agentes que dañan el ADN se utiliza un ensayo para cuantificar el daño del ADN en las células o núcleos aislados a partir de individuales tejidos de animales tratados con el material (s) potencialmente genotóxicos. Debido a sus ventajas, el ensayo cometa in vivo se recomienda como un segundo ensayo in vivo de genotoxicidad (emparejado con el ensayo de micronúcleos in vivo) para la realización de evaluaciones de seguridad de productos en la corriente de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) 3 y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (AESA 4) las directrices reguladoras. En nuestro laboratorio, hemos empleado el ensayo para evaluar el daño del ADN in vivo inducida por ingredientes de alimentos, productos farmacéuticos y los nanomateriales en 5-10. de hígado de rata se utiliza como un ejemplo en este protocolo, pero el ensayo de cometa se puede realizar con otros tejidos / órganos de animales de experimentación, siempre que las células individuales intactos pueden ser aisladas de tejido.
Ciertos tipos de daño en el ADN son difíciles de detectar como roturas de la cadena de ADN sin modificar el ensayo cometa alcalino básico. En el caso de daño oxidativo del ADN, hebra breaks se pueden crear en lesiones oxidativas en el ADN por digestión con enzimas de reparación, tales como humano 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilasa 1 (hOGG1, que crea roturas en 8-oxoguanina (8-oxoGua) y metil-Fapy-guanina 11. también, endonucleasa III (Endo III) crea rompe principalmente en pirimidinas oxidadas 1. Así, la adición de una etapa de enzima-digestión hace que el ensayo de un método específico y sensible para medir el daño oxidativo del ADN in vivo 12. Utilizando estos ensayos, hemos demostrado daño oxidativo del ADN tóxico inducido en el hígado de ratas y ratones 6-8 y en el corazón de ratas 10.
El ensayo cometa alcalino tiene muchas aplicaciones en la toxicología genética y control biológico humano: 1) como un seguimiento en el ensayo in vivo para genotoxinas sensibles identificados por los ensayos in vitro 3,13, 2) para evaluar los mecanismos de daño en el ADN-xenobióticos inducida en múltiples tejidos 14, 3) para investigar si unacarcinógeno funciona mediante un modo no genotóxico de acción (MOA) 7 genotóxico o, 4) para evaluar el ADN a reparar el daño 15, 5) para investigar enfermedades humanas y las exposiciones ocupacionales 16, y 6) como un ensayo de cribado de alto rendimiento potencial de -órgano específico genotoxicidad 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la medición simultánea de tanto el daño de ADN directa y oxidativo en el hígado de rata a nivel de células individuales. El protocolo general es aplicable a cualquier tejido del que las células individuales o núcleos se pueden aislar con un mínimo de daño en el ADN de procesamiento inducida (es decir, el daño del ADN inducido no por el agente de ensayo, pero por el manejo y procesamiento de los tejidos animales). En nuestra investigación, hemos llevado a cabo el ensayo del com…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the US Food and Drug Administration. We acknowledge the original publication of the CPA study by Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)
Materials
| Coverslips (No. 1, 24 x 50 mm) | Fisher | 12-544-14 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-123 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Fisher | 67-68-5 | |
| EDTA, Disodium | Fisher | BP120-1 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher | ICN1860454 | |
| 1X Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca++, Mg++ free) | HyClone | SH30588.02 | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Low Melting Point Agarose (LMP) | Lonza | 50081 | NuSieve GTG Agarose |
| Normal Melting Agarose (NMA) | Fisher | BP1356-100 | |
| pH testing paper strips (pH 7.5-14) | Fisher | M95873 | |
| Potassium Cloride | Fisher | 7447-40-7 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher | 1310-58-3 | |
| slide labels, (0.94 x 0.5 in.) | Fisher | NC9822036 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | 7647-14-5 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | 1310-73-2 | |
| SYBR™ Gold | Invitrogen | S11494 | |
| Triton X-100 | Fisher | 9002-93-1 | |
| Trizma Base | Fisher | 77-86-1 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-6 | |
| Cell strainer (40 µm) | Fisher | 22363547 | |
| Endonuclease III (Nth) | New England Biolabs | M0268S | Dilution 1:1000 |
| hOGG1 | New England Biolabs | M0241S | Dilution 1:1000 |
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