إنتاج نوروفيروس الإبراز المجالات الإنسان في<em> E. القولونية</em> لأشعة البلورات
Summary
هنا، نحن تصف طريقة للتعبير عن وتنقية نوروفيروس جودة عالية جاحظ (P) في المجالات E. القولونية لاستخدامها في دراسات البلورات بالأشعة السينية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة إلى مجالات الفيروسة الكأسية P الأخرى، وكذلك البروتينات غير الهيكلية، أي، البروتين المرتبط بالفيروس الجينوم (VPG)، الأنزيم البروتيني، والحمض النووي الريبي RNA يعتمد البلمرة (RdRp).
Abstract
يتكون القفيصة نوروفيروس من البروتين الهيكلي رئيسي واحد، ووصف VP1. وينقسم VP1 إلى (S) نطاق قذيفة وجاحظ (P) المجال. يشكل المجال S سقالة متجاورة حول RNA الفيروسي، في حين أن الأشكال نطاق P المسامير الفيروسية في المجال S ويحتوي على المحددات لاستضداد والمضيف خلية التفاعلات. المجال P يربط الهياكل الكربوهيدرات، أي، المستضدات مجموعة HISTO الدم، والتي يعتقد أنها ستكون مهمة للعدوى نوروفيروس. في هذا البروتوكول، ونحن تصف طريقة لانتاج نوعية عالية المجالات نوروفيروس P في عوائد عالية. ويمكن بعد هذه البروتينات يمكن استخدامها لالبلورات بالأشعة السينية وELISA لدراسة استضداد والمضيف خلية التفاعلات.
واستنساخ المجال P أولا إلى ناقلات التعبير وثم أعرب في البكتيريا. يتم تنقيته البروتين باستخدام ثلاث خطوات التي تنطوي يجمد معدن أيون تقارب اللوني واللوني حجم الإقصاء. فيمبدأ، فمن الممكن استنساخ، صريحة، تنقية، وبلورة البروتينات في أقل من أربعة أسابيع، الأمر الذي يجعل هذا البروتوكول نظام سريع لتحليل سلالات فيروس النورو الناشئة حديثا.
Introduction
noroviruses الإنسان هي السبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء الحاد في جميع أنحاء العالم 1. هذه الفيروسات تنتمي إلى عائلة فيروسات كأسية، التي يوجد على الأقل خمسة أجناس، بما في ذلك نوروفيروس، Sapovirus، Lagovirus، Vesivirus، وNebovirus. وعلى الرغم من التأثير الكبير على نظام الرعاية الصحية وتوزيع واسعة، ويعوق دراسة noroviruses الإنسان من عدم وجود نظام خلية ثقافة قوية. حتى الآن، لا توجد لقاحات المعتمدة أو الاستراتيجيات المضادة للفيروسات المتاحة.
ونوروفيروس البروتين قفيصة كبير، ووصف VP1، يمكن تقسيمها إلى (S) نطاق قذيفة وجاحظ (P) للنطاق 2. يتم توصيل المجال P إلى المجال S من منطقة المفصلي مرن (H). يشكل المجال S سقالة حول RNA الفيروسي، في حين يشكل المجال P الجزء الأبعد من قفيصة الفيروسية. يجمع المجال P إلى dimers ذات الصلة بيولوجيا عندما أعرب في البكتيريا. ف دIMER يتفاعل مع الهياكل الكربوهيدرات، يسمى المستضدات مجموعة HISTO الدم (HBGAs) التي تكون موجودة كمستضدات القابلة للذوبان في اللعاب وجدت في بعض الخلايا المضيفة 3. ويعتقد أن P التفاعل المجال HBGA إلى أن تكون مهمة للإصابة 4. في الواقع، وكشف تقرير صدر مؤخرا على أهمية HBGAs تركيبية أو HBGA، معربا عن البكتيريا لعدوى فيروس النورو البشري في المختبر 5.
يتم تنفيذ الدراسات الحالية بشأن مرفق الخلية المضيفة من noroviruses أساسا مع جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) التي يمكن التعبير عنها في خلايا الحشرات أو مع مجالات P المؤتلف وأعرب في القولونية (إي كولاي). لفهم P التفاعلات المجال HBGA في قرار الذري والهياكل P المجال HBGA معقدة لا يمكن حلها باستخدام البلورات بالأشعة السينية. هنا، نحن تصف بروتوكول للتعبير عن نطاق P وتنقية الذي يسمح إنتاج نطاق P في كمية وجودة عالية لاستخدامها في البلورات بالأشعة السينيةography. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة لغيرها من المجالات الفيروسة الكأسية P والبروتينات غير الهيكلية.
وكودون الأمثل المجال P لE. التعبير القولونية والمستنسخة في ناقلات نقل القياسية. ثم يتم إعادة المستنسخة المجال P إلى ناقلات التعبير الذي يشفر polyhistidine (صاحب) العلامة وبروتين ملزمة المانوز (ب ب) التي يتم اتباعها من قبل موقع البروتيني انشقاق. يتم التعبير عن م ب ب-صاحب ف انصهار بروتين المجال في E. القولونية، تليها ثلاث خطوات تنقية. يتم تنقيته وم ب ب-صاحب ف انصهار بروتين المجال باستخدام يجمد اللوني المعادن أيون تقارب (ايماك). بعد ذلك، هو المشقوق البروتين الانصهار مع فيروسات الانف الإنسان (الهريفي) البروتيني -3C ويتم فصل المجال ف من ب ب-صاحب كتبها خطوة إضافية لتنقية ايماك. وأخيرا، يتم تنقيته المجال P باستخدام الكروماتوغرافيا حجم الاستبعاد (SEC). ويمكن بعد ذلك المجال P تنقيته أن تستخدم لالبلورات بالأشعة السينية. فحص الظروف البروتين بلورة هو PERFOrmed مع مجموعات الفرز المتاحة تجاريا باستخدام تركيزات مختلفة من البروتين نطاق P. لوحظ نمو البلورات ويتم تحسين الظروف الواعدة.
مع الأساليب المذكورة هنا، فمن الممكن أن يذهب من الجين إلى البروتين لهيكل خلال أقل من أربعة أسابيع. لذلك، أسلوبنا في التعبير ف مجال تنقية وبلورة مناسبة لدراسة التفاعل نوروفيروس المضيفة على المستوى الجزيئي، وتوفير البيانات الهامة للمساعدة في ما يصل إلى تاريخ لقاح تصميم والمخدرات الفرز.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف بروتوكول للتعبير وتنقيتها من المجالات P نوروفيروس في ذات جودة عالية وكمية. Noroviruses لم يتم دراستها جيدا، وهناك حاجة إلى بيانات الهيكلية بشكل مستمر. على حد علمنا، فإن P إنتاج المجال باستخدام بروتوكولات أخرى (على سبيل المثال، الموسومة GST المجالات P) إشكال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses’ fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
