Производство человека Norovirus выступающую Домены в<em> E. палочки</em> Для рентгеновской кристаллографии
Summary
Здесь мы опишем метод , чтобы выразить и очистить высокое качество Norovirus выступающие (P) доменов в E. палочки для использования в исследованиях рентгеновской кристаллографии. Этот метод может быть применен к другим кальцивируса P доменов, а также неструктурные белки, то есть., Вирусный белок геном-сшитый (ВПГ), протеазы и РНК зависимой РНК – полимеразы (RdRp).
Abstract
Норовирусная капсид состоит из одного основного структурного белка, названного VP1. VP1 подразделяется на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена. Домен S образует непрерывную леску вокруг вирусной РНК, в то время как P доменных форм вирусные шипы на домене S и содержит детерминанты для антигенности и хост-клеточных взаимодействий. Домен P связывает углеводные структуры, то есть., Групповые антигены гисто-крови, которые считаются важными для норовируса инфекций. В этом протоколе, мы описываем способ получения высококачественных норовирус P домены с высокими выходами. Эти белки могут быть использованы для рентгеновской кристаллографии и ELISA с целью изучения антигенных свойств и хост-клеточных взаимодействий.
Домен Р сначала клонирован в вектор экспрессии и экспрессии в клетках бактерий. Белок очищают с помощью трех шагов, которые включают иммобилизованных металл-ионную аффинной хроматографии и эксклюзионной хроматографии. Впринцип, можно клонировать, экспресс, очищают, и кристаллизуются белки менее чем за четыре недели, что делает этот протокол система быстрого анализа вновь возникающих штаммов Norovirus.
Introduction
Человеческие Noroviruses являются основной причиной острого гастроэнтерита во всем мире 1. Эти вирусы принадлежат к семейству Caliciviridae, из которых по крайней мере пять родов, в том числе норовирус, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus и Nebovirus. Несмотря на их высокую воздействие на систему здравоохранения и широкое распространение, изучение человеческих норовирусами затруднено из-за отсутствия надежной системы клеточной культуры. На сегодняшний день нет никаких утвержденных вакцин или противовирусных стратегий, доступных.
Норовирусная основной белок капсида, названный VP1, можно разделить на оболочку (S) домена и выступающую (P) домена 2. Домен Р подключен к домену S областью гибкого шарнира (H). Домен S образует леску вокруг вирусной РНК, в то время как домен Р образует дальний от центра часть вирусного капсида. Домен P компонует в биологически соответствующих димеров при экспрессии в бактериях. P dИМЕР взаимодействует с углеводными структурами, называемые антигены групп гисто-крови (HBGAs), которые присутствуют в виде растворимых антигенов в слюне и обнаружили на некоторых клетках – хозяевах 3. Взаимодействие домена HBGA Р считается важным для инфекции 4. В самом деле, недавний доклад показал важность синтетических HBGAs или HBGA экспрессирующих бактерии для инфекции норовирусной человека в пробирке 5.
Современные исследования , касающиеся вложения клетки – хозяина норовирусами в основном осуществляется с вирусоподобных частиц (VLPs) , которые могут быть выражены в клетках насекомых или рекомбинантных P доменов , выраженных в Escherichia coli (E.coli). Для того, чтобы понять P предметно-HBGA взаимодействия с атомным разрешением, P предметно-HBGA сложные структуры могут быть решены с помощью рентгеновской кристаллографии. Здесь мы опишем протокол для выражения Р домена и очистки, что позволяет производить области Р в высоком количестве и качестве, которые будут использоваться для рентгеновской Crystallграфия. Кроме того, этот метод может быть применен для других кальцивируса P доменов и неструктурных белков.
Домен P является кодон-оптимизированной для Е. палочка экспрессии и клонируют в стандартный вектор переноса. Домен Р затем повторно клонирована в вектор экспрессии, который кодирует полигистидиновая (His) тэг и маннозы-связывающий белок (МВР), которые, за которым следует сайт расщепления протеазы. -His-P МВР слитый домен белок экспрессируется в E. палочки, а затем три стадии очистки. Гибридный домен белка ОБМ-His-P очищают с помощью иммобилизованным ионом металла аффинной хроматографии (IMAC). Затем слитый белок расщепляют с человеческим риновирусной (ВРС) -3C протеазы и домен Р отделяется от MBP-His, с помощью дополнительной стадии очистки IMAC. И, наконец, домен Р очищают с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенный домен P может затем использоваться для рентгеновской кристаллографии. Скрининг условий кристаллизации белков является Перфоrmed с коммерчески доступными наборами скрининга с использованием различных концентраций белка P домена. Рост кристаллов наблюдается и наиболее перспективные условия оптимизированы.
С методами, описанными здесь, можно перейти от гена к белку структурировать в течение менее четырех недель. Таким образом, наш метод выражения P домена, очистки и кристаллизации подходит для изучения взаимодействия норовирус-хозяина на молекулярном уровне и обеспечивают важные данные для оказания помощи в последнюю дату разработкой вакцин и наркотиков скрининг.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол для экспрессии и очистки норовируса P доменов в высоком качестве и количестве. Норовирусы недостаточно хорошо изучены и постоянно необходимы структурные данные. Насколько нам известно, производство домен P с использованием других протоколов (например, GST-?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.
Materials
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 cm x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. Three-dimensional structure of calicivirus. J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses’ fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
