Produksjon av menneske norovirus utstående domener i<em> E. coli</em> For røntgenkrystallografi

Summary

Her beskriver vi en metode for å uttrykke og rense høy kvalitet norovirus utstå (P) domener i E. coli for anvendelse ved røntgenkrystallografi studier. Denne fremgangsmåten kan anvendes for andre calicivirus P domener, så vel som ikke-strukturelle proteiner, f.eks., Viralt genom proteinbundet (VPG), protease, og RNA-avhengig RNA-polymerase (RdRp).

Abstract

Den norovirus kapsid er sammensatt av et enkelt større strukturell protein, betegnet VP1. VP1 er inndelt i et skall (S) domene og et fremstikkende (P) domene. S domene danner en sammenhengende stillas rundt viral RNA, mens P domene former virus pigger på S domene og inneholder determinanter for antigenisitet og vert-celle interaksjoner. P domene binder karbohydratstrukturer, altså., Histo-blodtypeantigener, som antas å være viktig for norovirus-infeksjoner. I denne protokollen beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av høykvalitets norovirus P domener i høye utbytter. Disse proteinene kan deretter brukes for røntgenkrystallografi og ELISA for å studere antigenisitet og vert-celle-interaksjoner.

P-domenet blir først klonet inn i en ekspresjonsvektor og deretter uttrykt i bakterier. Proteinet blir renset ved bruk av tre trinn som involverer immobilisert metall-ion-affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi. Iprinsippet er det mulig å klone, ekspress, rense og krystallisere proteiner i mindre enn fire uker, noe som gjør denne protokollen et hurtig system for å analysere nylig nye norovirus stammer.

Introduction

Menneske noroviruses er den viktigste årsaken til akutt gastroenteritt på verdensbasis ^en. Disse virusene tilhører caliciviridae familien, som det er minst fem slekter, inkludert Norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, og Nebovirus. Til tross for sin høye innvirkning på helsevesenet og bred distribusjon, er studiet av menneskelige noroviruses hemmet av mangel på en robust cellekultur system. Til dags dato er det ingen godkjente vaksiner eller antiviral strategier tilgjengelig.

Den norovirus store kapsidprotein, betegnet VP1, kan deles inn i et skall (S) domene og et fremstikkende (P) domene ^2. P-domenet er koblet til S-domenet ved et fleksibelt hengsel (H) region. S-domenet danner et stillas rundt det virale RNA, mens P-domenet danner den ytterste del av det virale kapsid. P domene samler inn biologisk relevante dimer når det uttrykkes i bakterier. P dimer samhandler med karbohydratstrukturer, kalt histo-blodtypeantigener (HBGAs) som er til stede som løselige antigener i spytt og på enkelte vertsceller ^3. P domene-HBGA interaksjon antas å være viktig for infeksjon ^4. Faktisk en fersk rapport avslørte betydningen av syntetiske HBGAs eller HBGA-uttrykke bakterier for mennesker norovirus-infeksjon in vitro ^fem.

Gjeldende studier angående vertscellefesting av noroviruses er hovedsakelig utført med viruslignende partikler (VLP) som kan uttrykkes i insektceller eller med rekombinante P domener uttrykt i Escherichia coli (E. coli). For å forstå P domene-HBGA interaksjoner på atom oppløsning, kan P domene HBGA komplekse strukturer løses ved hjelp av røntgenkrystallografi. Her beskriver vi en protokoll for P domene ekspresjon og rensing som tillater produksjon av P-domenet i høy kvantitet og kvalitet til å bli brukt for X-ray crystallography. Videre kan denne fremgangsmåte anvendes for andre calicivirus P domener og ikke-strukturelle proteiner.

P domenet er kodonoptimaliserte for E. coli-ekspresjon og klonet inn i en standard overføringsvektor. P domene blir deretter på nytt klonet inn i en ekspresjonsvektor som koder for et polyhistidin (His) tag og et mannose-bindende protein (MBP) som er etterfulgt av et protease spaltningssete. MBP-His-P domene fusjonsprotein blir uttrykt i E. coli, etterfulgt av tre rensetrinn. MBP-His-P domene fusjonsproteinet ble renset ved hjelp av immobilisert metallion-affinitetskromatografi (IMAC). Deretter blir fusjonsproteinet spaltes med humant rhinovirus (HRV) 3C protease og P-domenet er skilt fra MBP-His ved et ytterligere IMAC rensetrinn. Til slutt, P domene renset ved anvendelse av størrelseseksklusjonskromatografi (SEC). Den rensede P domene kan deretter brukes for røntgenkrystallografi. Screening av protein krystallisering forhold er gjengivelseRMED med kommersielt tilgjengelige screening kits med ulike P domeneproteinkonsentrasjoner. Krystallvekst observeres, og de mest lovende betingelsene er optimalisert.

Med de metoder som er beskrevet her, er det mulig å gå fra gen til protein for å strukturere i løpet av mindre enn fire uker. Derfor er vår fremgangsmåte for P domene uttrykk, rensing og krystallisering egnet for å studere norovirus-vert interaksjon på molekylært nivå og gir viktige data for å hjelpe til med opp-to-date vaksine utforming og medikament-screening.

Protocol

1. P Domain Cloning Bestem P domene kodende region ved sekvenssammenstillingen av norovirus stammer (f.eks GII.10 belastning, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. Dessuten fjerner den fleksible området ved den C-terminale enden av den P-domenet (figur 2A). Kodon-optimalisere DNA for E. coli uttrykk og inkluderer BamHI (N-terminal) og Noti- (C-terminal) restriksjonsseter i orden til sub-klone P domene kodende region inn i pMalc2x ekspresjonsvektor 6,7. <…

Representative Results

Skjematisk av den beskrevne protokoll er vist i figur 1. Protokollen omfatter 6 hoveddeler som omfatter kloning av målgenet, ekspresjon, en tre-trinns rensing og krystallisasjon. Figur 2 viser utformingen av ekspresjonskonstruksjonen (EC) og egenskapene til pMalc2x ekspresjonsvektoren. Sekvensen av det multiple kloningssete (MCS) av pMalc2x vektoren viser restriksjons og protease-spaltningsseter. Figur 3 viser representative SDS-PAGE re…

Discussion

Her beskriver vi en protokoll for uttrykket og rensing av norovirus P domener i høy kvalitet og kvantitet. Noroviruses er ikke godt studert og strukturelle data er kontinuerlig behov. Så vidt vi vet, har P domene produksjon ved hjelp av andre protokoller (f.eks GST-merket P domener) vært problematisk, så langt, og tilstrekkelige strukturelle data på norovirus-vert samhandling har vært mangler. Med metoden beskrevet her, har vi nylig bidratt vesentlig til forståelsen av de molekylære detaljene for norovi…

Materials

P domain DNA	Life Technologies		GeneArt Gene Synthesis
pMalc2x  vector	On request
BamHI	New England Biolabs	R0136L
NotI	New England Biolabs	R0189L
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
S.O.C. Medium	Life Technologies	15544-034
Econo-Column Chromatography Column	Bio-Rad	7372512	2.5 cm x 10 cm, possible to use other size
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210
Vivaspin 20	GE Healthcare	various	cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Life Technologies	18265-017
One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli	Life Technologies	C6000-03
HRV 3C Protease	Merck Millipore	71493
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	SEC column
JCSG Core suites	Qiagen	various	4 screens with each 96 wells
Carbohydrates	Dextra Laboratories, UK	various	Blood group products