Transfert de gènes dans l'organe de poulet Auditory par<em> Dans Ovo</em> Micro-électroporation
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
Embryons de poulet sont des systèmes modèles idéaux pour l' étude du développement embryonnaire manipulations de la fonction des gènes peuvent être effectuées avec une relative facilité in ovo. L'organe sensoriel auditif de l'oreille interne est essentiel pour notre capacité à entendre. Il abrite un épithélium hautement spécialisé sensorielle qui se compose de cellules ciliées mécano-transduction (CAH) et entourant gliales comme des cellules de soutien (SC). En dépit des différences structurelles dans les organes auditifs, les mécanismes moléculaires qui régulent le développement de l'organe auditif sont évolutivement conservées entre mammifères et aves Dans électroporation ovo est en grande partie limitée aux premiers stades de E1 -. E3. En raison du développement tardif relatif de l'organe auditif à E5, les manipulations de l'organe auditif par électroporation ovo passé E3 sont difficiles en raison du développement avancé de l'embryon de poulet aux stades ultérieurs. La méthode présentée ici est une méthode de transfert de gène transitoire pour le ciblage de gènes d'intérêt àétape E4 – E4.5 dans l'organe sensoriel auditif de poulet en développement par l' intermédiaire d' in ovo micro-électroporation. Cette méthode est applicable à intensité forte et perte de fonctions avec le plasmide classique des vecteurs d'expression à base d' ADN et peut être combiné avec dans un essai de prolifération cellulaire in ovo en y ajoutant EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) pour l'ensemble de l' embryon au le temps de l'électroporation. L'utilisation de la protéine fluorescente verte ou rouge (GFP ou RFP) plasmides d'expression permet à l'expérimentateur de déterminer rapidement si le succès électroporation ciblé la partie auditive de l'oreille interne en développement. Dans cette méthode papier, des exemples représentatifs des spécimens de GFP électroporation sont illustrés; les embryons ont été récoltées 18-96 heures après l' électroporation et le ciblage de la GFP dans la région pro-sensorielle de l'organe auditif a été confirmée par hybridation d' ARN in situ. Le document de la méthode fournit également un protocole optimisé pour l'utilisation de la thymidine analogique EdU pour analyser des cellules prolifration; un exemple d'un essai de prolifération cellulaire sur la base EdU qui combine l'immuno-marquage et cliquer sur le EdU chimie est fourni.
Introduction
En dépit des différences dans la morphologie et la structuration cellulaire entre le mammifère et l' organe sensoriel auditif aviaire, les facteurs moléculaires et les voies responsables du développement de HC sensorielle sont pensés pour être évolutivement conservée 1-3. La papille basilaire, qui abrite le HCS auditifs et leurs SCs environnantes, se développe comme un outpocketing du otocyste de l'oreille interne. Au début d'une piscine de progéniteurs HC et SC est spécifié dans le / otique domaine compétente tasse neuronal-sensorielle placode otique (NSD). Les données cartographiques destin montrent que les lignées de neurones sensoriels et sont liés et découlent de la NSD située dans la région antéro-ventrale de la coupelle ou otique otocyste chez les souris et les poulets 4,5. Tout d'abord, les neuroblastes délaminage de la NSD pour donner naissance à des neurones du ganglion auditif-vestibulaire, qui a finalement divisé en ganglion auditive et vestibulaire. Ces neurones innervent les CAH sensorielles de l'oreille interne et des noyaux du tronc cérébral. Les cellules ièmeà rester dans le NSD sont pensés pour donner lieu à divers patchs sensoriels, y compris l'organe sensoriel auditif, composé des CAH sensorielles mécano-transduction et leurs SCs associés.
Dans les deux le poussin et murin, progéniteur sensorielle sortie du cycle cellulaire organe auditif et la différenciation HC se produisent dans des gradients opposés. Dans poussin, la sortie du cycle cellulaire progéniteur auditif commence autour ~ E5 et progresse depuis la base jusqu'au sommet, et du centre vers la périphérie 6. Un jour plus tard, la différenciation HC commence au sommet et avance vers la base 7. L' étude du développement de l'oreille interne chez le poulet présente de nombreux avantages techniques des mécanismes fonctionnels peuvent être étudiés avec une relative facilité in ovo , par opposition à la manipulation d' embryons in utero dans d' autres systèmes modèles, ce qui nécessite des chirurgies complexes. La méthode décrite ici utilise en micro-électroporation ovo pour cibler des gènes d'intérêt dans le Basila présomptifr zone papille antéro-ventral dans la vésicule otique spécifiquement à E4.
Électroporation in ovo est une technique qui est bien établie et couramment utilisé 8-14. Le principe de la technique d'électroporation est basée sur le fait que les nucléotides (par exemple, ADN plasmidique, l' ADN synthétique, l' ARN ou des oligonucléotides) sont chargées négativement. L'ADN est injecté dans le tissu d'intérêt. Lorsqu'un courant électrique est placé à travers le tissu, le courant transitoire ouvre les pores dans les parois cellulaires et permet l'absorption de l'ADN, sous forme de flux de l'ADN chargé négativement vers l'électrode positive (anode). Pour des expériences de gain de fonction, les gènes d'intérêt sont généralement sous-clonés dans des plasmides d'expression qui contiennent des cassettes d'expression appropriés pour la protéine fluorescente verte (GFP) ou la protéine fluorescente rouge (RFP). Pour la perte de fonction des expériences dominantes des constructions à base de plasmide négatif répresseurs ou ARNi ou constructions morpholino sont commonly utilisé 15,16. Pour inhiber microARN (miARN) miARN fonction d' assemblage d'épongé, qui sont généralement à base de plasmide, peut être utilisé 17. La méthode décrite ici permet d'enquêter sur les mécanismes moléculaires qui contrôlent la prolifération et la différenciation dans l'organe auditif, comme dans la méthode micro-électroporation ovo peut être facilement combiné avec dans le dosage de prolifération cellulaire ovo en ajoutant EdU à l'ensemble de l' embryon.
L'électroporation et l'addition de EdU est effectuée à E4 dans la vésicule otique, qui est un jour avant le début de la sortie du cycle cellulaire dans l'organe auditif. L'analyse de l'organe auditif est généralement effectuée 18-96 heures après électroporation à E5 (début de sortie du cycle cellulaire progéniteur sensorielle), E6 (début de la différenciation HC) et E7 (lors de la différenciation HC); et plus tard jusqu'à ~ E9 (fin de la différenciation des HC). Cette méthode d'électroporation de transfert de gènes est transitoire d'une durée approximative ~ 4 jours, because les gènes d'intérêt ne pas intégrer dans le génome, mais la méthode est applicable pour une utilisation avec le plasmide approprié des vecteurs d'expression à base d' ADN, qui ont la capacité d'intégrer dans le génome, comme le transfert de gène Tol2 médiée 11. Avec cette méthode de GFP robuste ou une expression RFP dure ~ 4 jours dans la cochlée, après quoi les signaux pointent fanent, mais fournissent une fenêtre de temps suffisant pour étudier le développement complexe de l'organe auditif. Cette in ovo méthode de transfert de gènes est nouveau et permet de cibler spécifiquement l'organe auditif présomptif à E4, qui est optimal pour les enquêtes qui mettent l' accent sur le développement de HC dans l'organe auditif. Il est un bon ajout à d' autres méthodes, qui électroporation à des stades de développement beaucoup plus jeunes ou 11,12 par rapport à l'utilisation de cultures in vitro d'explants de papilles basilaire 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le procédé décrit ici de micro-électroporation in ovo est optimisé pour le transfert de gène dans l'organe auditif développement. Il est compatible avec les plasmides vecteurs d'expression à base d'ADN utilisés habituellement pour manipuler la fonction du gène / expression. Le moment de l'électroporation à E4 est optimal pour les enquêtes qui mettent l'accent sur le développement de HC dans l'organe auditif. Les étapes les plus critiques sont micro-injecter l'ADN dans …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Doris K. Wu pour les plasmides d'expression et de sondes in situ, le Centre de l' Université Johns Hopkins pour Sensory installation d'imagerie de la biologie et le Centre d'audience et de l' équilibre. Ce travail a été soutenu par NIDCD Grant T32 DC000023 à LE
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
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