Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em> In Ovo</em> Micro-Elektroporation
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
Hühnerembryonen sind ideale Modellsysteme zur Untersuchung embryonaler Entwicklung als Manipulationen der Genfunktion kann mit relativer Leichtigkeit in ovo ausgeführt werden. Das Innenohr Gehörsinnesorgan ist für unsere Fähigkeit, kritisch zu hören. Es beherbergt eine hochspezialisierte Sinnesepithel, die von mechano-Umwandlungs-Haarzellen (HC-) und der umgebenden Glia artigen Stützzellen (SCs) besteht. Trotz struktureller Unterschiede in den Gehörorgane, sind die molekularen Mechanismen , die Entwicklung des Hörorgans Regulieren evolutionär konservierten zwischen Säugetieren und Aves In ovo Elektroporation frühen Stadien bei E1 weitgehend begrenzt ist -. E3. Aufgrund der relativ späte Entwicklung des Hörorgan bei E5, Manipulationen des Hörorgan durch in ovo Elektroporation Vergangenheit E3 sind aufgrund der fortgeschrittenen Entwicklung des Hühnerembryo schwer in späteren Phasen. Die hier vorgestellte Methode ist eine vorübergehende Gentransferverfahren für Gene von Interesse Targeting anStufe E4 – E4.5 im Hühner auditorischen Sinnesorgan über de – ovo – Mikro-Elektroporation zu entwickeln. Dieses Verfahren ist anwendbar für Verstärkungs- und loss-of-Funktionen mit herkömmlichen Plasmid – DNA-basierten Expressionsvektoren und kann durch Zugabe von EDU (5-ethinyl-2'-desoxyuridin) zu den gesamten Embryo in der mit in ovo – Zellproliferationstest kombiniert werden Zeitpunkt der Elektroporation. Die Verwendung von grün oder rot fluoreszierende Protein (GFP bzw. RFP) Expressionsplasmide ermöglicht dem Experimentator, um schnell festzustellen, ob die Elektroporation erfolgreich den auditorischen Abschnitt des Entwicklungsinnenohr abgezielt. Bei diesem Verfahren wird Papier, repräsentative Beispiele für GFP elektroporiert Proben veranschaulicht; 96 Stunden nach der Elektroporation und des Hörorgans zur pro-sensorischen Bereich der GFP – Targeting wurde von RNA in situ – Hybridisierung bestätigt – Embryonen wurden 18 geerntet. Das Verfahren Papier stellt auch ein optimiertes Protokoll für die Verwendung des EdU Thymidinanalogon Zelle prolif zu analysierenration; ein Beispiel für eine EdU basierte Zellproliferationsassays, die Immunmarkierung kombiniert und klicken Sie auf EdU Chemie vorgesehen.
Introduction
Trotz der Unterschiede in der Morphologie und Zell Strukturierung zwischen Säugetieren und Vogel auditorischen Sinnesorgan, die molekularen Faktoren und Wege verantwortlich für die sensorische HC Entwicklung sind gedacht , um evolutionär 1-3 konserviert werden. Die basilar Papille, die den Gehör HCs und der sie umgebenden SCs beherbergt, entwickelt als Aussackung des Innenohrs otocyst. Früh auf einem Pool von HC und SC Vorläufern ist innerhalb der Ohrplakode / otic Tasse neuralen sensorische zuständigen Domain (NSD) angegeben. Fate-Mapping – Daten belegen , dass die neuronale und sensorischen Linien verbunden sind und von der NSD entstehen in der antero-ventralen Bereich des otic Tasse befindet oder otocyst bei Mäusen und Huhn 4,5. Zunächst delaminieren Neuroblasten aus der NSD Vorrücken in den Neuronen des auditorischen-vestibulären Ganglion zu geben, die schließlich in Hör- und Gleichgewichts Ganglien gespalten. Diese Neuronen innervieren die sensorischen HCs des Innenohrs und Kerne im Hirnstamm. Die Zellen thbei der NSD bleiben werden gedacht, Anlass zu verschiedenen Sinnes Patches zu geben, einschließlich Gehörsinnesorgan, der mechano-Umwandlungs-sensorischen HCs und ihre zugehörigen SCs aus.
In den beiden Küken und Maus, Hörorgan sensorischen Vorläuferzellzyklus verlassen und HC Differenzierung treten bei Steigungen entgegenwirkt. In Küken beginnt auditorischen Vorläuferzellzyklus – Ausgang um ~ E5 und schreitet von der Basis bis zur Spitze, und vom Zentrum zur Peripherie 6. Einen Tag später HC Differenzierung beginnt im Scheitel und schreitet zu der Basis 7. Das Studium der Entwicklung des Innenohres in Huhn bietet viele technische Vorteile als Funktionsmechanismen können mit relativer Leichtigkeit in ovo im Gegensatz zu manipulieren Embryonen in utero in anderen Modellsystemen untersucht werden, die komplexe Operationen erfordert. Das hier beschriebene Verfahren nutzt in ovo Mikro Elektroporation Gene von Interesse in der vermutlichen Basila Zielr Papille Bereich anterior-ventral in dem Ohrbläschen speziell bei E4.
Elektroporation in ovo ist eine Technik , die gut etabliert ist und häufig verwendet 8-14. Das Prinzip der Elektroporation Technik basiert auf der Tatsache , dass Nukleotiden (zB Plasmid – DNA, synthetische DNA oder RNA – Oligonucleotide) sind negativ geladen. Die DNA wird in das interessierende Gewebe injiziert. Wenn ein elektrischer Strom über das Gewebe gelegt wird, öffnet sich der Strom transiente Poren in den Zellwänden und ermöglicht die Aufnahme der DNA, da die negativ geladenen DNA der positiven Elektrode fließt in Richtung (Anode). Für gain-of-function Experimente werden Gene von Interesse in Expressionsplasmide gewöhnlich subkloniert, die geeigneten Expressionskassetten für das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder rot fluoreszierendes Protein (RFP) enthalten. Für loss-of-function Experimente plasmid-basierten dominant negative Repressor-Konstrukten oder RNAi oder Morpholino Konstrukte commonly verwendet 15,16. Zur Hemmung microRNA (miRNA) Funktion miRNAs Schwamm Konstrukte, die typischerweise Plasmid basiert, 17 verwendet werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es, die molekularen Mechanismen zu untersuchen , die Proliferation und Differenzierung in Hörorgans steuern, wie die in ovo Mikro Elektroporationsverfahren kann leicht durch Zugabe von mit in ovo – Zellproliferationstest kombiniert werden EdU auf den gesamten Embryo.
Die Elektroporation und die Zugabe von EdU bei E4 in der Ohrbläschen durchgeführt, die einen Tag vor dem Beginn der Zellzyklus-Ausgang in dem Hörorgan ist. Die Analyse des Hörorgan ist in der Regel durchgeführt, 18-96 Stunden nach der Elektroporation bei E5 (Beginn der sensorischen Vorläuferzellzyklus-Ausgang), E6 (Beginn der HC Differenzierung) und E7 (bei HC Differenzierung); und später bis ~ E9 (Ende HC Differenzierung). Dieses Elektroporation Verfahren des Gentransfers ist vergänglich etwa ~ 4 Tage dauert, because die Gene von Interesse nicht integrieren in das Genom, aber das Verfahren ist anwendbar für die Verwendung mit geeigneten Plasmid – DNA-basierten Expressionsvektoren, die die Fähigkeit tun haben , in das Genom, beispielsweise Tol2 vermittelten Gentransfer 11 zu integrieren. Mit dieser Methode robust GFP oder RFP Ausdruck dauert ~ 4 Tage in der Cochlea, nach welchem Punkt die Signale verblassen, noch bieten eine reichliche Zeitfenster die komplizierte Entwicklung des Hörorgan zu studieren. Diese de – ovo – Gentransferverfahren ist neu und ermöglicht, speziell auf die vermutliche Hörorgan bei E4 Ziel, die für die Untersuchungen optimal ist, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Es ist eine gute Ergänzung zu alternative Verfahren, die bei viel jüngeren Entwicklungsstadien 11,12 oder im Vergleich zur Verwendung von in vitro basilar Papillen Explantatkulturen 18 elektroporieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren der de – ovo – Mikro Elektroporation wird für den Gentransfer in die Entwicklungs Hörorgan optimiert. Es ist kompatibel mit Plasmid-DNA basierenden Expressionsvektoren typischerweise verwendet, um die Genfunktion / Ausdruck zu manipulieren. Der Zeitpunkt der Elektroporation bei E4 ist für Untersuchungen optimal, die im Hörorgan auf HC Entwicklung konzentrieren. Die wichtigsten Schritte sind die DNA in das Ohrbläschen Lumen Mikrospritz ohne mit der Nadel geht zu tief…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Doris K. Wu für Expressionsplasmide und de – situ – Sonden, die Johns Hopkins University Center für Sinnesbiologie Bildgebung Anlage und das Zentrum für Hören und Gleichgewicht. Diese Arbeit wurde von NIDCD Grants T32 DC000023 zu LE unterstützt
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
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