Studieren Wnt Signaling Während Patterning of Conducting Airways
Summary
Die Verwendung von Reporter – Mäuse gekoppelt ganze Berg und Abschnitt Färbung, Mikroskopie und de – vivo – Tests erleichtert die Analyse der Mechanismen , die die normale Strukturierung der Atemwege zu Grunde liegen. Hier beschreiben wir, wie diese Techniken zur Analyse der Wnt-Signal während trachealen Entwicklung beigetragen.
Abstract
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Introduction
Respirationstrakt Entwicklung wird durch embryonaler Tag 9 (E9) mit dem Auftreten von Nkx2.1 – positiven Zellen in der Bauch endodermalen foregut 1,2 eingeleitet. Ösophagus-Trachealtubus Trennung wird durch E11.5 lösen , wenn die Rohre als getrennte Einheiten unterschieden werden kann, die jeweils 3 durch mesenchymale Gewebe umgeben. Wnt – Signalisierung spielt eine Schlüsselrolle in der Spezifikation des Respirationstraktes wie Deletion Wnt2 und Wnt2b durch die splanchnic Mesenchym und Löschung von β-Catenin von der endodermalen respiratorischen Epithels exprimiert wird in Lunge agenesis 4,5 führen. Unsere früheren Studien festgestellt , dass das Löschen von Wls, einer Ladung Rezeptor vermittelnde Sekretion aller Wnt – Liganden, von den endodermaler Atemwege führt zu Lungenhypoplasie, Mängel bei der pulmonalen Gefäßentwicklung und Fehl Strukturierung der trachealen Mesenchyms 6,7. Diese Daten unterstützen die Bedeutung der epithelial-mesenchymalen cross sprechen bei der Zelldifferenzierung und der Beschreibung , wie es auch in anderen Studien 8,9 gezeigt wurde.
Die Untersuchung der frühesten Stadien der Lungenentwicklung stützt sich auf genetische, in vitro und ex vivo – Techniken , die uns besser erlaubt haben , Mechanismen zu verstehen , Atem Identität Fahr 16.10. Ganze Lunge Explantatkulturen am Luft Flüssigkeit Interphase wurden in frühen Stadien der Lungenverzweigungs Morphogenese 10,17,18 die Effekte der Wachstumsfaktoren zu untersuchen weithin verwendet. Während dieses Verfahren als Auslesen von morphologischen Veränderungen verwendet wird, wie beispielsweise Verzweigungs Morphogenese und Genexpressionsmodulation, ist es für das Studium der frühen Stadien des Entwicklungsprozesses begrenzt, da die Kultur selbst nicht die Entwicklung der Vaskulatur 17 unterstützt. Entwicklung Trachealknorpels erfordert längere Inkubationszeiten, die nicht mit dieser Kultur-Technik kompatibel sind.
Um Analyze die Rolle der Wnt-Signal während der Atemwege Bildung haben wir Standardtechniken angepasst auf die Bedürfnisse unserer embryonalen Studien zu erfüllen. Wir haben Volumina geändert, Färbungszeiten, Bearbeitungs Radfahren für Paraffineinbettung und den Zeitpunkt für die Reinigung der Tracheal-Lungengewebe. Das Hauptziel der Techniken in der vorliegenden Studie beschrieben Optimierung war die frühesten Stadien der trachealen Entwicklung bei Mäusen zu analysieren, die von E11 bis E14,5 stattfinden. Unter Verwendung der Reportermäuse Linie Axin2LacZ wir genau bestimmten Stellen von Wnt / β-Catenin – Aktivität in der Entwicklung von trachealen Mesenchym. Wir haben auch Lektin Färbeverfahren für ganze Berg Luftröhrengewebe angepasst. So konnten wir mesenchymalen Verdichtungen zu visualisieren und zu Websites, vorherzusagen, wo Chondrogenese stattfinden wird. Die Färbung der ganze Berg und Abschnitte von embryonalem Gewebe erhalten von WlsShhCre Mäuse, gepaart mit erweiterten Mikroskopietechniken, erlaubt uns , die Rolle der Wnt – Liganden durch die tra produziert zu enthüllenCheal Epithel in trachealen Musterung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veranstaltungen der Morphogenese der Atemwege zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden, insbesondere die für die Strukturierung der leitenden Atemwege erforderlichen Prozesse. Frühere Studien haben ex vivo – Techniken verwendet , wobei die Entwicklung Explantate kultiviert werden an der Luft-Flüssigkeit – Zwischenphasen – oder eingebettet in Matrigel 21,22. Diese Studien haben gezeigt, wie Wachstumsfaktoren, die Strukturierung der Entwicklungs Trachea und die Bildung von Trachealknorpel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen die Unterstützung von Mike Muntifering und Matt Kofron mit konfokaler Bildgebung und Gail Macke mit histologischen Verfahren. Diese Arbeit wurde teilweise von der National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 DS) unterstützt.
Materials
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
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