실시 항공의 패터닝 동안 Wnt 신호를 공부
Summary
전체 마운트에 연결된 리포터 생쥐 부 염색 현미경 및 생체 내 분석에 사용은 호흡기 정상 패터닝 기전의 분석을 용이하게한다. 여기에서 우리는 이러한 기술이 기관 개발하는 동안 Wnt 신호의 분석에 기여하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.
Introduction
호흡 기계의 개발은 복부 내배엽 foregut 1, 2에서 Nkx2.1 양성 세포의 모양과 배아 일 9 (E9)에 의해 시작된다. 튜브가 별개의 실체로 구별 할 수있는 경우 식도 – 기관 튜브 분리, E11.5에 의해 중간 엽 조직 (3)에 의해 둘러싸인 해결됩니다. Wnt 신호는 폐 무 발생 4,5가 발생합니다 내배엽 호흡기 상피 세포에서 내장의 중간 엽과 β-catenin의 삭제로 표현 subtype 중 Wnt2 및 Wnt2b의 삭제와 호흡기의 사양에 중요한 역할을한다. 우리의 이전 연구는 폐 형성 부전에서 내배엽 호흡기 결과에서, WLS, 모두의 Wnt 리간드의화물 수용체 매개 분비의 삭제를 결정, 폐 혈관 개발 및 기관 간엽 6,7의 잘못된 패턴의 결함. 이러한 데이터는 상피 간엽 CRO의 중요성을 지원그것은 또한 다른 연구 8,9에 도시 된 바와 같이, SS는, 세포 분화 및 명세서에 말한다.
폐 개발의 초기 단계의 연구는 우리가 더 나은 호흡 정체성 10-16 구동 메커니즘을 이해 할 수있는 생체 외 및 생체 기법, 유전자에 의존한다. 공기 액체 계면에서 전체 폐 이식편 배양 널리 형태 형성 10,17,18 분기 폐의 초기 단계에서 성장 인자의 효과를 연구하는데 이용되고있다. 이 방법 형태와 같은 분지 형태 형성과 같은 변경 및 유전자 발현 조절의 리드로서 사용되는 반면, 배양 자체가 혈관 (17)의 개발을 지원하지 않으므로, 발달 과정의 초기 연구에 제한되어있다. 기관 연골의 개발이 문화 기술과 호환되지 수 있습니다 이상 배양 시간이 필요합니다.
analyz하려면호흡기 형성시 Wnt 신호의 역할 즉, 우리는 배아 연구의 요구를 충족하기 위해 표준 기술을 채택했다. 우리는 볼륨, 염색 시간, 기관 – 폐 조직의 청산을위한 파라핀 삽입 및 타이밍에 대한 처리 사이클을 수정했습니다. 본 연구에 기재된 기술을 최적화의 주요 목표는 E14.5로 E11에서 일어나는 생쥐 기관 발달의 초기 단계를 분석 하였다. 기자 마우스 라인 Axin2LacZ 개발 기관의 중간 엽에서의 Wnt / β-catenin이 활동의 우리 정확하게 결정된 사이트를 사용. 우리는 또한 전체 마운트 기관 조직에 대한 렉틴 염색 절차를 적용했다. 따라서, 우리는 중간 엽 응축을 시각화하고 연골이 일어날 사이트를 예측할 수 있었다. 전체 마운트 및 고급 현미경 기술과 결합 WlsShhCre 마우스에서 얻은 배아 조직의 섹션의 염색은 TRA에 의해 생산의 Wnt 리간드의 역할을 공개 할 우리에게 허용기관 패터닝에 cheal 상피.
Protocol
Representative Results
Discussion
호흡 기관의 형태 형성의 기초 이벤트 완전히 도통기도의 패터닝에 필요한 공정, 특히 이해되지 않는다. 이전의 연구 개발 이식편 공기 – 액체 계면에서의 배양이나 마트 리겔 (21, 22)에 포함 된 상기 생체 외 기법을 이용 하였다. 성장 인자가 개발 기관의 패터닝 및 기관 연골의 형성에 미치는 영향이 연구에서 나타났다. 이러한 연구에 대한 제한은 상기 조직의 구조가 적절하게 유?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 조직 학적 절차에 마이크 Muntifering 및 공 초점 이미지와 매트 코프 론 (Kofron)와 게일 Macke의 도움을 인정합니다. 이 작품은 부분적으로 건강 NHLBI의 국립 연구소 (DS에 K01HL115447)에 의해 지원되었다.
Materials
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
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