Isolamento e caratterizzazione di un testa e del collo a cellule squamose Carcinoma sottopopolazione Avere Stem Cell Caratteristiche

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

Nonostante i progressi nella comprensione della testa e del collo progressione carcinomi a cellule squamose (HNSCC), il tasso di sopravvivenza a cinque anni rimane basso a causa di recidive locali e metastasi a distanza. Una ipotesi per spiegare questo recidiva è la presenza di cellule staminali simil-tumorali (CSC) che presentano chemio intrinseca e radio-resistenza. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, è necessario disporre di modelli sperimentali che convalidano l'efficacia dei trattamenti mirati e quindi avere metodi affidabili per l'identificazione e l'isolamento di CSC. A tal fine, presentiamo un protocollo per l'isolamento di CSC da linee cellulari umane HNSCC che si basa sulla combinazione di due cernite successive cellulari eseguite da cellule attivate a fluorescenza (FACS). Il primo si basa sulla proprietà di CSC per overexpress ATP-binding cassette (ABC) proteine ​​di trasporto e quindi di escludere, tra gli altri, i coloranti DNA vitali come Hoechst 33342. Le celle ordinate con °è il metodo sono identificati come "popolazione side" (SP). Come le cellule SP rappresentano una bassa percentuale (<5%) di cellule parentali, una fase di crescita è necessaria al fine di aumentare il loro numero prima della seconda separazione delle cellule. Il passaggio successivo consente la selezione di cellule che possiedono due altre caratteristiche di cellule staminali HNSCC esempio alto livello di espressione del marcatore di superficie cellulare CD44 (CD44 ^alto) e la sovraespressione di aldeide deidrogenasi (ALDH ^alto). Poiché l'uso di un singolo marcatore ha numerose limitazioni e trappole per l'isolamento del CSC, la combinazione di SP, CD44 e marcatori ALDH fornirà uno strumento utile per isolare CSC di ulteriori test analitici e funzionali richiedono cellule vitali. Le caratteristiche staminali-come CSC è stato finalmente validati in vitro dalla formazione di tumorispheres e l'espressione di β-catenina.

Introduction

Testa e del collo a cellule squamose di carcinoma (HNSCC) è un tumore comune in tutto il mondo e nonostante i progressi nei trattamenti attuali, i pazienti con malattia avanzata hanno una prognosi sfavorevole. Il tasso di sopravvivenza a 5 anni generale del paziente è di circa il 30%, nonostante la combinazione di approcci terapeutici tra cui la chirurgia, chemio-radioterapia e-terapie mirate. Recenti studi attribuiscono recidive locali e metastasi a distanza per la sopravvivenza delle cellule staminali simil-tumorali (CSC) a seguito di terapie antitumorali ^1. Ci sono prove a sostegno accumulando l'esistenza di cellule che presentano cellule staminali proprietà (capacità di stato indifferenziato, auto-rinnovamento e differenziazione, e l'attività della telomerasi) in vari tumori solidi, tra cui seno, del cervello, della prostata, del polmone, del colon, del pancreas, del fegato e della pelle ^{2- 10.} Tuttavia, l'origine della CSC rimane poco chiaro ^11,12. Essi possono derivare dalla trasformazione maligna delle cellule staminali normali ^3,13 o dedifferenziazione delle cellule tumorali che acquisiscono CSC-come caratteristiche ^14,15. Pertanto, la comprensione percorsi distintivi relativi a CSC fornirà spaccato la diagnosi precoce e il trattamento di HNSCC resistenti.

E 'stato proposto che CSC possiedono anche fenotipi resistenti che eludono chemioterapia standard e radioterapia, con conseguente ricaduta del tumore rispetto alla massa di cellule tumorali ^16-19 e sono localizzate in ipossico nicchie ^20. Numerosi fattori sono stati proposti per spiegare queste resistenze di CSC, come la propensione al quiescenza, migliorato di riparazione del DNA, up-regolati meccanismi di controllo del ciclo cellulare, Kärcher radicali liberi ^21. Inoltre, diversi percorsi molecolari oncogeni possono essere attivati ​​in modo specifico CSC ^17. Al fine di migliorare la conoscenza della CSC per ulteriori mirate terapie, abbiamo bisogno di metodi affidabili per l'identificazione e l'isolamento di CSC, a causa della eterogeneità dei marcatori di cellule staminali nel legativari tipi di tumori ^22.

In HNSCC, staminali simil-cellule tumorali-inizio sono stati isolati da tumori di pazienti primario di classificare cellule che esprimono diversi biomarcatori CSC (come ad esempio l'efflusso di droga trasportatori espressione ^23, CD44 ^{alto, alto} CD24 ^basso CD133, c-Met ⁺ fenotipo ^{10,24, 25,} o ALDH ^alta attività ²⁶⁾ o la coltivazione di tumore primario del paziente in modo da formare squamospheres che hanno proprietà CSC. Tuttavia, il numero di squamospheres diminuisce drasticamente dopo due passaggi, dando così un campione di dimensioni piccole per un'ulteriore caratterizzazione studi ^27. Pertanto, test in vitro a partire da linee cellulari ben consolidata è una soluzione più facile da progettare esperimenti, al fine di migliorare la conoscenza della CSC.

Lo scopo di questo articolo è quello di proporre un metodo per isolare CSC da linee cellulari HNSCC utilizzando multiparametrica citometria a flusso di analisi di unND cellule di smistamento. L'espressione di CD44 in correlazione con diverse proprietà CSC compresa l'attività ALDH, laterale della popolazione (SP) fenotipo, capacità formazione sferoide e tumorigenicità sono utilizzati per isolare e caratterizzare questa sotto-popolazione di CSC. CD44, una glicoproteina sulla superficie cellulare, è coinvolto nella adesione cellulare e la migrazione. CD44 è altamente espresso in molti tumori solidi CSC ^28, anche nel cancro della testa e del collo modelli ^29-31. Inoltre, ^alti cellule CD44 possono generare in vivo un tumore eterogeneo, mentre CD44 ^bassi cellule non possono ^10. Il saggio SP si basa sul potenziale differenziale delle cellule per efflusso il colorante Hoechst ²² attraverso la famiglia ATP-binding cassette (ABC) del trasportatore proteine ​​overexpressed all'interno della membrana CSC. Questo test prevede l'uso di inibitori del trasportatore ABC come verapamil in campioni di controllo. Deidrogenasi (ALDH) è un enzima intracellulare che è coinvolto nella conversione di retinolo a macerareL'acido inoic durante staminali precoce differenziazione delle cellule ^25,26. Le cellule che presentano l'attività spettacolo staminali come il comportamento delle cellule di alta ALDH in HNSCC ²⁶ e pochissimi numero di ^alta cellule ALDH sono in grado di generare tumori in vivo ^26,32.

La combinazione di questi marcatori e proprietà è stato usato con successo da Bertrand e t al. Per studiare la resistenza in vitro e in vivo di questi CSC PHOTON e ​​ioni di carbonio radiazioni ^19. I loro risultati hanno mostrato chiaramente che la combinazione di vari marcatori e le proprietà delle cellule sono più selettivi per gli studi sulle popolazioni utili HNSCC CSC di approcci singolo marcatore.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida locali sulla cura degli animali. Tutti i dettagli di questo studio sono stati approvati dal CECCAPP, un comitato etico francese. 1. Selezione di una popolazione Side (SP) dalla Hoechst Dye Efflux Assay Colorazione 50 milioni di cellule con colorante Hoechst 33342. Preparare due 15 ml provette sterili con fondo conico: un tubo con l'etichetta "Hoechst" e uno con l'etichetta "Hoechst e Vera…

Representative Results

L'isolamento di CSC da linee cellulari HNSCC richiesto due successive di smistamento a causa della bassissima percentuale di CSC nella linea cellulare dei genitori. La prima cernita era basato sulla capacità di CSC di escludere il colorante Hoechst causa di trasportatori di efflusso droga. Ciò ha comportato l'acquisizione del 1-5% della popolazione totale di cellule filtrate (Figura 1). Durante il colorante Hoechst ordinamento cellulare negativa, controllare la…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo affidabile per l'isolamento successo di CSC da una linea cellulare specifica che è applicabile ad altre linee cellulari HNSCC. Isolati testa e del collo CSC sono quindi adatte per l'ulteriore caratterizzazione molecolare in vitro e validazione funzionale da trapianto in topi immunodeficienti ^19. Tuttavia, alcune modifiche possono essere testate seconda popolazione lato o le ^alte percentuali ^alta / ALDH CD44 presenti nella linea cellu…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–