頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の進行の理解の進歩にもかかわらず、5年生存率は、局所的再発および遠隔転移に低いままです。この再発を説明するための1つの仮説は、固有の化学療法および放射線抵抗性を提示するがん幹細胞様細胞（CSCは）の存在です。新たな治療戦略を開発するためには、標的治療の有効性を検証する実験モデルを有し、したがって、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要です。この目的のために、我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって実行二つの連続するセルソーティングの組み合わせに依存しているヒトHNSCC細胞株からのCSCを単離するためのプロトコルを提示します。第1は、ヘキスト33342などの重要なDNA色素は細胞が目にソートし、ATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質を過剰発現するため、除外し、他の人の間でするのCSCのプロパティに基づいていますこの方法は、「サイドポピュレーション」（SP）として識別されています。 SP細胞は親細胞の（<5％）低いパーセンテージを表すように、成長期には、第二の細胞選別の前にそれらの数を増加させるために必要です。次のステップは、他の二つのHNSCC幹細胞の特性は、細胞表面マーカーCD44（ ^高 CD44）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現（ALDH ^高い ）の高発現レベル、すなわち有する細胞の選択を可能にします。単一のマーカーの使用は、CSCを単離するための多数の制限および落とし穴を有するため、SP、CD44およびALDHマーカーの組み合わせは、生細胞を必要とするさらなる分析および機能的アッセイのためのCSCを単離するための有用なツールを提供します。 CSCの幹のような特性は、最終的にtumorispheresの形成とβカテニンの発現によりin vitroで検証しました。

Introduction

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）は、世界的に一般的な悪性腫瘍であり、現在の治療法の進歩にもかかわらず、進行した疾患を有する患者は予後不良です。患者の全体の5年生存率は、手術、化学療法、放射線療法及び標的 – 療法を含む治療法の組み合わせにもかかわらず、約30％です。最近の研究では、抗がん治療¹次がん幹細胞様細胞（CSCは）の生存に局所再発および遠隔転移を属性。乳房、脳、前立腺、肺、結腸、膵臓、肝臓および皮膚^2-含む種々の固形腫瘍における幹細胞の特性（未分化状態、自己再生および分化能力、およびテロメラーゼ活性）を提示する細胞の存在を支持する証拠が蓄積されています^10。しかし、CSCをの起源は^11,12不明のままです。これらは、正常な幹細胞^3,13またはdedifferenの悪性転換から生じ得ますCSCのような機能^14,15を獲得^する腫瘍細胞のtiation。したがって、CSCをに関連する独特の経路を理解することは耐性HNSCCの早期診断と治療への洞察を提供します。

それのCSCはまた、腫瘍細胞のバルク^16〜19と比較し、低酸素ニッチ²⁰内に局在する腫瘍の再発を生じ、標準的な化学療法および放射線療法を回避耐性の表現型を有することが提案されています。多くの要因は、静止の傾向としてのCSCのこれらの抵抗、強化DNA修復、アップレギュレートされ、細胞周期制御機構、及びフリーラジカルスカベンジャー^21を説明するために提案されています。また、いくつかの発癌分子経路は、具体的にCSCを¹⁷で活性化されてもよいです。さらにターゲット・治療のためのCSCの知識を向上させるために、我々は、中の幹細胞関連マーカーの不均一性のために、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要癌²²の様々なタイプ。

HNSCCにおいて、幹様腫瘍開始細胞が^、そのような薬物排出トランスポーターの発現²³と異なるCSCバイオマーカー（CD44 ^高 、CD24 ^低 CD133 ^高 、のc-Met ^+表現型^10,24を発現^する細胞を選別することにより、一次患者の腫瘍から単離されています^25、またはALDH ^高活性^26）またはCSC特性を有するsquamospheresを形成するために、主要な患者の腫瘍を栽培。それにもかかわらず、squamospheresの数は、このように、さらなる特徴付けのための小さなサンプルサイズが^27を研究^して与え、2継代後に劇的に減少します。したがって、十分に確立された細胞株から出発インビトロアッセイのCSCの知識を向上させるために実験を設計するための簡単なソリューションです。

この記事の目的は、マルチパラメトリックフローサイトメトリー分析aを用いHNSCC細胞株からのCSCを単離するための方法を提案することですNDセルソーティング。 ALDH活性を含むいくつかのCSCの特性との相関におけるCD44の発現は、サイドポピュレーション（SP）の表現型、スフェロイド形成能と腫瘍形成を分離したCSCのこのサブ集団を特徴付けるために使用されます。 CD44、細胞表面糖タンパク質は、細胞接着および遊走に関与しています。 CD44は、高度に頭頸部癌モデル^29-31を含め、CSCを²⁸多くの固形腫瘍で発現されます。 CD44 ^low細胞が¹⁰できないのに対し、さらに、CD44 ^高細胞は、in vivo異種の腫瘍を発生させることができます。 SPアッセイは、CSC膜内で過剰発現トランスポータータンパク質のATP結合カセット（ABC）ファミリーを介しヘキスト色素^22を流出する細胞の差電位に基づいています。このアッセイでは、対照試料中のベラパミルなどのABCトランスポーター阻害剤の使用を含みます。アルデヒド脱水素酵素（ALDH）は、RETにレチノールの変換に関与する細胞内酵素であります初期の幹細胞の分化^25,26の間inoic酸。高いALDH活性ショーHNSCC ²⁶における幹様細胞の挙動およびALDH ^高い細胞の非常に少ない数を示す細胞は、 インビボ ^26,32 に腫瘍を生成することができます。

これらのマーカーとプロパティの組み合わせが正常にベルトラン間tのアルで使用されていた。 インビトロ及び光子と炭素イオン照射¹⁹にこれらのCSCの生体内で抵抗を研究します。それらの結果は、様々な細胞マーカーおよび特性の組み合わせは、単一のマーカーのアプローチよりHNSCCのCSC集団に関する有用な研究のために、より選択的であることを示しました。

Protocol

すべての動物の手順は、動物のケアのローカルガイドラインに従って行いました。本研究の全ての詳細はCECCAPP、フランスの倫理委員会によって承認されました。 ヘキスト染料流出アッセイによるサイドポピュレーション（SP）の1選定ヘキスト33342染料を用いて50万個の細胞を染色します。 1「ヘキスト」と表示されたチューブと「ヘキストとベラパミル」と表示され?…

Representative Results

HNSCC細胞株からのCSCの単離は、理由親細胞株でのCSCの非常に低い割合の2つの連続した​​ソートを必要としました。最初のソートは、薬物排出トランスポーターによるヘキスト色素を排除するためのCSCの能力に基づいていました。このソート全細胞集団（ 図1）の1〜5％の獲得をもたらしました。ヘキスト染料負の細胞選別の間、SSCドットプロット（ <stro…

Discussion

このプロトコルは、他のHNSCC細胞系にも適用可能である特定の細胞株からのCSCの成功を単離するための信頼できる方法を記載しています。孤立した頭と首のCSCは、その後、免疫不全マウス¹⁹内移植によるvitroおよび機能的検証のさらなる分子特性に適しています。しかし、いくつかの変更は、サイドポピュレーションまたは親細胞株中に存在するCD44 ^高 / ALDH ^高…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–