Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

Summary

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Abstract

la ricerca Exosome negli ultimi tre anni ha notevolmente ampliato la portata verso l'identificazione e la caratterizzazione di biomarcatori e loro usi terapeutici.

Esosomi sono stati recentemente dimostrato di contenere microRNA (miR). Mirs si sono sorti come biomarcatori preziosi per scopi diagnostici. Come la raccolta di campioni nelle cliniche e negli ospedali è molto variabile, miRNA isolamento da tutta la bile varia notevolmente. Per ottenere solidi, precisi e riproducibili profili miRNA da campioni di bile raccolti in modo semplice richiesto lo sviluppo di un protocollo di alta qualità per isolare e caratterizzare esosomi dalla bile. Il metodo richiede diversi centrifugazioni e una fase di filtrazione con un passo ultracentrifugazione finale per far sedimentare le esosomi isolati. La microscopia elettronica, Western blot, citometria a flusso e multi-parametro analisi ottica di nanoparticelle, se disponibili, sono passi fondamentali di caratterizzazione per convalidare la qualità del messaggio exosomes. Per l'isolamento di miRNA da questi esosomi, chiodare il lisato con un non-specifica, miRNA sintetico da una specie come Caenorhabditis elegans, vale a dire, Cel-miR-39, è importante per la normalizzazione di efficienza di estrazione di RNA. L'isolamento di exosome dal liquido biliare seguendo questo metodo consente la riuscita miRNA profilatura da campioni di bile conservati per diversi anni a -80 ° C.

Introduction

Come altri fluidi biologici, vale a dire, il latte materno, plasma o urina, la bile contiene esosomi, lipidi vescicole ricche ^1-4. Esosomi possono indurre o alterare le funzioni biologiche in cellule riceventi ^{5, 6,} una forma di comunicazione cellula-cellula che potrebbe essere parte della loro normale funzione ^{4, 7-9.} Esosomi possono contenere specie miRNA che possono fornire una preziosa fonte di biomarcatori per la diagnosi ^10. profili miRNA hanno guadagnato considerevole attenzione negli ultimi anni come marcatori diagnostici e prognostici per una varietà di malattie ^11-14.

miRNA stesso può essere trovato in fluidi biologici, eventualmente rilasciati da cellule morte e la quantità di cellule capannone può essere fortemente influenzato da una malattia di base. Il profilo di miRNA exosomes non riflette necessariamente il profilo miRNA della cellula originaria ^{6, 10, 15-17,} ma exosomes può effettuare firme miRNA che potrebbero essere caratteristico per la ce genitorill come una cellula tumorale. Exosomes tumore-derivato sono stati identificati nel plasma dei pazienti con adenocarcinoma del polmone, cancro alla prostata e di altri tumori ^{8, 16, 18.}

L'obiettivo di questo metodo è l'isolamento affidabile e robusta di esosomi da campioni bile umana, in gran parte indipendenti delle loro procedure di gestione precedenti. E 'stato sviluppato per utilizzare la bile come una fonte affidabile di miRNA per il potenziale diagnosi delle malattie del dotto biliare, come colangiocarcinoma ^19. Si compone di diverse fasi di centrifugazione con l'aumentare della velocità per isolare esosomi e potrebbe essere applicabile ad altri fluidi biologici.

Protocol

Ottenere la bile da pazienti di colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP) richiede l'approvazione di un protocollo di studio soggetti umani dal Institutional Review Board. Tutto il lavoro qui presentato è stato approvato dal Comitato Etico della Johns Hopkins University. 1. Exosome Isolamento da Bile Eseguire colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP). Posizionare il paziente in posizione supina e intubare. Passare una duodenoscopio attraverso …

Representative Results

Poiché esosomi sono troppo piccole per essere rilevato mediante microscopia normale o la citometria a flusso, microscopia elettronica o analisi ottica nanoparticelle deve essere eseguita. L'analisi ottica nanoparticelle ha il vantaggio rispetto microscopia elettronica che è anche quantitativa e fornisce distribuzione dimensionale e concentrazione. Lo strumento presenta un raggio laser finemente focalizzato attraverso un prisma di vetro nel campione. Il moto browniano delle vescicol…

Discussion

Per utilizzare in modo affidabile esosomi isolati dalla bile, è importante utilizzare metodi di isolamento di alta qualità costante per ottenere campioni di alta qualità in cambio. La metodologia definita in questo documento è un modo consolidato per isolare esosomi e miRNA dalla bile umana. Si evidenzia diversi passaggi cruciali nella caratterizzazione dei esosomi isolati che come minimo dovrebbe comprendere microscopia elettronica o l'analisi ottica di nanoparticelle e macchie occidentali.

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Materials

0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter	Corning	431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331374
SW40Ti rotor	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
cOmplete Protease Inhibitor	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871