Выделение и профилирование микроРНК содержащих экзосомы от человека Bile

Summary

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Abstract

Исследование экзосома в течение последних трех лет значительно расширили сферу в сторону идентификации и характеристики биомаркеров и их терапевтического применения.

Экзосомы недавно было показано, содержат микроРНК (Мирс). Миры сами по себе возникли как ценные биомаркеров для диагностических целей. Как сбор проб в клиниках и больницах довольно изменчиво, микроРНК изоляция от всей желчи существенно различается. Для достижения надежных, точных и воспроизводимых профилей микроРНК из собранных образцов желчи простым способом потребовало разработки протокола высокого качества, чтобы выделить и охарактеризовать экзосомы от желчи. Метод требует несколько центрифугировани и стадию фильтрации с конечной стадией ультрацентрифугирования, чтобы осадить обособленные экзосомы. Электронная микроскопия, Вестерн-блоты, проточной цитометрии и многопараметрического наночастицами оптический анализ, если таковые имеются, являются важнейшими этапами определения характеристик для проверки качества еxosomes. Для выделения микроРНК из этих экзосомы, спайковой лизата с неспецифическим, синтетический микроРНК из вида , как Caenorhabditis Элеганс, т.е. Cel-микроРНК-39, имеет важное значение для нормализации эффективности экстракции РНК. Выделение экзосома из желчной жидкости следуя этому методу позволяет успешно микроРНК профилирование из образцов желчи, хранившихся в течение нескольких лет при температуре -80 ° С.

Introduction

Как и в других биологических жидкостях, то есть грудное молоко, плазме крови или моче, желчи содержит экзосомы, богатой липидами везикулы ^1-4. Экзосомы могут вызывать или изменять биологические функции в клетки – реципиенты ^{5, 6,} форма межклеточной связи , которая может быть частью их нормальной функции ^{4, 7-9.} Экзосомы может содержать видов микроРНК , которые могут обеспечить ценный источник биомаркеров для диагностики ^10. профили микроРНК получили значительное внимание в последние годы в качестве диагностических и прогностических маркеров различных заболеваний ^{11-14 лет.}

Сам микроРНК можно найти в биологических жидкостях, возможно, высвобождаемых мертвых клеток и количество пролитой клеток может в значительной мере зависеть от основного заболевания. Профиль микроРНК экзосом не обязательно отражает профиль микроРНК от инициирующего элемента ^{6, 10, 15-17,} но экзосомы может нести подписи микроРНК , которые могут быть характерны для родителей CEбудете как клетка опухоли. Опухолевые полученных экзосомы были идентифицированы в плазме пациентов с аденокарциномой легкого, рака предстательной железы и других опухолей ^{8, 16, 18.}

Целью данного метода является надежным и надежная изоляция экзосомы из образцов желчи человека, в значительной степени зависит от их предыдущих процедур обработки. Она была разработана , чтобы использовать желчь в качестве надежного источника микроРНК для потенциальной диагностики заболеваний желчных протоков , таких как холангиокарциномой ^19. Она состоит из нескольких этапов центрифугирования при увеличении скорости, чтобы изолировать экзосомы и могут быть применимы и к другим биологическим жидкостям.

Protocol

Получение желчи от больных к эндоскопической ретроградной холангиопанкреатография (ЭРХПГ) требует утверждения человеческого протокола Испытуемых Советом по рассмотрению Institutional. Все работы, представленные здесь было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета …

Representative Results

Поскольку экзосомы слишком малы, чтобы быть обнаружены с помощью регулярной микроскопии или поточной цитометрии, электронная микроскопия или оптический анализ наночастиц должен быть выполнен. Оптический анализ наночастица имеет преимущество по сравнению с электро…

Discussion

Для того, чтобы надежно использовать экзосомы, выделенные из желчи, важно использовать последовательные методы высокого качества изоляции, чтобы получить высокие образцы качества взамен. Методика определена в данной работе является устоявшейся способ изолировать экзосомы и микроРН?…

Materials

0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter	Corning	431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331374
SW40Ti rotor	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
cOmplete Protease Inhibitor	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871