개구리와 도롱뇽의 생활 난 모세포에서 거대한 Lampbrush 염색체의 분리
Summary
우리는 개구리와 도롱뇽의 난자 생활에서 거대한 전사적으로 활성 lampbrush 염색체 분리에 대한 간단한 기술을 제시한다. 우리는 위상차 또는 미분 간섭 대비하는 방법과 현장 하이브리드 또는 면역 염색에서 형광을 위해 그들을 해결하는 방법에 의해 "살아"이러한 염색체를 관찰하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
우리는 개구리와 도롱뇽의 난자 또는 unlaid 계란에서 발견 된 거대한 전사적으로 활성 lampbrush 염색체 (LBCs)를 공부하는 방법을 설명합니다. 개인 LBCs의 최대 길이는 1mm 될 수 있으며 직경 0.5 mm로, 거대한 핵 자체를 상주합니다. 염색체의 크기가 커서 빛의 광학 현미경으로 활성 유전자 비할 관측을 허용하지만, 동시에 특별한 기술은 핵을 단리 핵막을 제거하고, 현미경 슬라이드 상 염색체 확산 필요하다. 또한 새싹 소포 (GV)라는 난자의 핵은 핵 굴지의 부분 겔을 허용하고 LBCs의 섬세한 구조를 보존하는 매체에 격리됩니다. 이 단계는 보석의 겸자를 사용하여 해부 현미경을 수동으로 수행된다. 다음으로, 핵 봉투는 보석의 집게 다시 수동으로 제거됩니다. 핵 내용은 신속하게 분산 외장 물감 매체로 전송굴지 젤 노변 장치 및 손상되지 않은 LBCs는 현미경 슬라이드에 정착 할 수 있습니다. 미세한 세부 사항은 브라운 운동에 의해 가려하고 있지만이 시점에서 LBCs 및 기타 핵 세포 소기관은, 위상차 또는 미분 간섭 대비 현미경으로 볼 수 있습니다. 고해상도 현미경 관찰 또는 분자 분석을 위해, 전체 제조는 슬라이드에 단단히 섬세한 LBCs를 연결하는 원심 분리된다. 파라 포름 알데히드에 대한 간단한 고정 후 면역 염색으로 또는 현장 하이브리드에 따른다. LBCs는 전사적으로 활성 상태에있는 자신의 거대한 크기는 촛점 또는 초해 현미경을 사용하여 개별 유전자 수준의 분자량 분석을 허용한다.
Introduction
대부분의 척추 동물은, 유대류와 태반 포유류의 주목할만한 예외로 큰 노른자위의 계란을 생산하고 있습니다. 그들의 때로는 거대한 크기에도 불구하고,이 계란은 여성의 난소에있는 동안 아직 최종 차원에 도달 한 세포이다. 난소 계란 난자라고 각각은 일반적으로 단순히 새싹 소포 또는 GV으로 초기 19 세기부터 알려진 하나의 거대한 핵을 포함하고 있습니다. 일반 실험실 개구리, Xenopus의의 laevis의 및 Xenopus의의 tropicalis의 1 난 모세포는 1.2 mm 및 0.8 mm 각각 (그림 1)의 최대 직경에 도달한다. 직경 0.4 mm (그림 2, 3) -이 두 개구리의 성숙한 난자에서 GVS는 0.3이다. 도롱뇽은 일반적으로 더 큰 난자와 GVS 있습니다. 멕시코 아 홀로 틀, Ambystoma mexicanum의 완전히 성숙 난자는 직경이 2mm 이상이며, GV는 약 0.5 mm이다. 따라서, 이러한 핵 육안 및 캔을 쉽게 볼 수 있습니다전형적인 체세포 핵으로 불가능한 다양한 방법으로 조작 될 수있다.
마찬가지로 현저한은 GV, 19 세기 말에 이미 인식 사실 내 염색체의 거대한 크기이다. Ambystoma 다른 도롱뇽의 개별 염색체의 길이는 최대 1mm (그림 4, 5)이 될 수 있습니다. 100 μm의 이상 최대 길이로, 그들은 대부분의 생물의 일반적인 체세포 염색체를 난쟁이하지만 Xenopus의의 사람들은 작은 상당한 있습니다. 한 쌍의 측면 루프 백 (그림 5) – 난자의 염색체의 중요한 특징은 자신의 가장 특징적인 형태 학적 특징 중 하나에 이르게 자신의 특별한 전사 활동이다. 각 루프는 적극적으로 RNA를 합성 하나 또는 몇 전사 단위로 구성되어 있습니다. 루프는 난자가 피상적 후 이름이 "lampbrush"염색체에지도 퍼지 모양을 염색체 제공등유 램프 굴뚝을 청소하기 이전 시대에 사용 된 브러쉬에 유사. 이
이 논문의 초점은 LBCs 핵 세포 소기관 (핵소체, 히스톤 궤적 기관 및 얼룩을) 연구 고립 GVS의 사용에 있습니다. 두 아니라 다른 기술을 설명한다. 첫번째, 일반적인 기술에서, GVS 간단히 부착 난황을 제거하는 세정 보석의 집게를 이용하여 식염수에서 격리하고, 핵막은 보석의 집게 다시 제거된다. LBCs 핵 세포 소기관을 포함하는 젤라틴 내용은 유리 현미경 슬라이드 나 커버 슬립 상에 침강한다. 이러한 제제는 위상차 또는 DIC 현미경으로 직접 관찰 할 수있다. 또한, 준비는 슬라이드 또는 커버 슬립에 LBCs와 세포 기관을 연결하는 원심 분리 될 수있다. 이러한 준비 후, 주로 면역 및 fluorescen하여 핵산 및 단백질 분자의 상세한 분석을 위해 처리 될 수있다현장 하이브리드 (FISH)에서 t. 3-7
두 번째 기술은 광유에서 GV의 분리를 포함한다. 8 오일 절연 GVS는 많은 시간 동안 전사적으로 활성 상태로 유지 한 핵 내용이 가능한 한 실물되고 싶어 연구를위한 잠재적으로 유용하다. 핵 "SAP"의 굴절률이 LBCs 및 기타 핵 세포 소기관 (그림 3)에 가까운이기 때문에 9, 10는, 현미경 기술은 석유 고립 GVS와 도전이 될 수 있습니다.
마지막으로, 그들의 크기와 조작의 용이성, GVS는 핵 봉투에 대한 연구에 이상적인 재료입니다. 핵 기공 단지는 최초의 수륙 양용 GV 봉투 (11)과 최근 수퍼 해상력의 관찰 전자 현미경 연구에서 설명 된 것과 동일한 재료를 사용하고 있습니다. 12, 13
Protocol
Representative Results
Discussion
개구리와 도롱뇽의 손으로 고립 GVS에서 "생활"LBCs의 첫 번째 관찰은 형광 면역 염색 전에 FISH 전에 미국의 생물 학자 윌리엄 Duryee, 위상차 및 DIC 현미경의 도입 전에 (19)에 의해 거의 80 년 전에 만들어졌다. 실제와 방식으로이를 해결하기 위해, 그들의 기본 형태를 파괴하지 않고 분자 기술을 적용, 유리 슬라이드에 LBCs를 연결하는 기술의 개별 유전자 레벨에 필요한 개발에서 염색?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
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