Выделение Giant хромосомы типа ламповых щёток из живых ооцитов Лягушки и саламандры
Summary
Мы представляем простые методы для выделения гигантских транскрипционно активных хромосом lampbrush из живых яйцеклеток лягушек и саламандр. Мы опишем , как соблюдать эти хромосомы "живой" с помощью фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста, и как установить их для флуоресцентной гибридизации на месте или иммунофлуоресцентного окрашивания.
Abstract
Описаны методы изучения гигантских транскрипционно активных хромосомы типа ламповых щёток (LBCS), найденный в ооцит или unlaid яйца, лягушек и саламандр. Индивидуальные LBCS может быть до 1 мм в длину, и они находятся в гигантском ядре, сама до 0,5 мм в диаметре. Большой размер хромосом позволяет беспрецедентные наблюдения активных генов с помощью световой оптической микроскопии, но в то же время специальные методы, необходимые для выделения ядра, удаление ядерной оболочки, и распространяя хромосомами на предметное стекло микроскопа. Ядро ооцита, также называется зародышевым пузырьком (GV), выделяют в среде, которая допускает частичное гелеобразование ядерного актина и сохраняет нежную структуру LBCS. Этот шаг выполняется вручную под микроскопом рассекает с помощью щипцов ювелира. Далее, ядерная оболочка удаляется, опять же вручную с помощью пинцета ювелира. Ядерные содержимое быстро переносили в среду, что dispeRSES гель актина и позволяет неповрежденные LBCS обосноваться на предметное стекло микроскопа. На этом этапе LBCS и другие ядерные органеллы могут быть просмотрены с помощью фазового контраста или дифференциального интерференционного контрастного микроскопа, хотя более тонкие детали затемнены броуновским движением. Для высокого разрешения наблюдения микроскопического или молекулярного анализа, весь препарат центрифугируют, чтобы прикрепить тонкие LBCS плотно к каретке. Краткая фиксация в параформальдегида затем следуют иммунофлуоресцентного окрашивания или гибридизация в. LBCS находятся в транскрипционно активном состоянии, и их огромный размер позволяет молекулярный анализ на индивидуальном уровне генов с помощью конфокальной или супер-разрешением микроскопии.
Introduction
Большинство позвоночных животных, за исключением сумчатых и плацентарных млекопитающих, производят большие yolky яйца. Несмотря на их иногда огромных размеров, эти яйца отдельные клетки, которые достигают их окончательный размер в то же время в яичнике самки. Яичниковые яйца называются ооциты , и каждый , как правило , содержит одно гигантское ядро, известное с начала 19 – го века как зародышевым пузырьком или просто GV. 1 ооцитов обычных лабораторных лягушек, Xenopus Laevis и Xenopus tropicalis, достигают максимального диаметра 1,2 мм и 0,8 мм соответственно (рис 1). В GVs из зрелых ооцитов этих двух лягушки 0,3 – 0,4 мм в диаметре (рисунки 2, 3). Саламандры, как правило, имеют даже более крупные ооциты и GvS. Полностью зрелые ооциты мексиканского аксолотля, Ambystoma mexicanum, более 2 мм в диаметре и GV составляет около 0,5 мм. Таким образом, эти ядра хорошо видны невооруженным глазом и может быть,можно манипулировать разными способами, которые невозможны с ядрами типичных соматических клеток.
Не менее примечательно , так это гигантский размер хромосом внутри Г.В., факт , признанный уже в конце 19 – го века. Отдельные хромосомы Ambystoma и других саламандр может быть до 1 мм в длину (рисунки 4, 5). Те из Xenopus значительны меньше, хотя и с длиной до 100 мкм или более, они затмевают типичные соматические хромосомы большинства организмов. Важной особенностью ооцитов хромосом является их необыкновенный транскрипционной активности, что приводит к одному из своих наиболее характерных морфологических признаков – сотни парных боковых петель (рисунок 5). Каждый цикл состоит из одного или нескольких единиц транскрипции, которые активно синтезируют РНК. Петли дают ооцитов хромосомы нечеткий вид, что привело к названию "lampbrush" хромосомы после того, как их поверхностныеСходство с кистей, используемых в прежние времена для чистки керосиновой лампы дымоходы. 2
В центре внимания данной работы находится на использовании изолированных GvS для изучения LBCS и ядерные органеллы (ядрышек, гистонов локусные тела и крапинки). Два весьма различные методы будут описаны ниже. В первом, более распространенной техникой, GVs изолированы в солевом растворе с помощью щипцов ювелира, кратко промыть, чтобы удалить прилипший желток, а ядерная оболочка удаляется, опять же с пинцетом ювелира. Студенистая содержание, содержащие LBCS и ядерные органеллы, дают отстояться на предметное стекло микроскопа или покровное. Такие препараты могут быть рассмотрены непосредственно фазового контраста или DIC микроскопии. В качестве альтернативы, препараты можно центрифугировать для прикрепления LBCS и органелл к слайду или покровное. Такие препараты могут быть обработаны для детального молекулярного анализа нуклеиновых кислот и белков, в первую очередь с помощью иммунофлуоресценции и fluorescenт гибридизация (FISH) в. 3-7
Второй метод предполагает изоляцию GV в минеральном масле. 8 Масло-изолированные GVs остаются транскрипционно активны в течение многих часов и потенциально полезны для исследований , в которых кто -то хочет ядерное содержимое , чтобы быть максимально реалистичное , насколько это возможно. 9,10 Поскольку показатель преломления ядерной "соке" близка к тому , что из LBCS и других ядерных органелл (рис 3), микроскопические методы могут быть проблемой с изолированным нефтью GvS.
Наконец, из-за их размера и простоты манипуляций, GVs являются идеальным материалом для исследований по ядерной оболочки. Пор комплекс атомной был впервые описан из электронно – микроскопических исследований на амфибий Г.В. конвертах 11 и более поздних наблюдений сверхразрешения использовали один и тот же материал. 12,13
Protocol
Representative Results
Discussion
Первые наблюдения «живых» LBCS из рук-изолированные GvS лягушек и саламандр были сделаны около 80 лет назад американский биолог Уильям Duryee, 19 до введения фазового контраста и ДИК микроскопии перед флуоресцентным иммунным окрашиванием и перед FISH. Преимущества LBCS для исследования дет?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research reported in this publication was supported by the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under award number R01 GM33397. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health. J.G.G. is American Cancer Society Professor of Developmental Genetics.
Materials
| Paraformaldehyde (reagent grade, crystalline) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Despite warnings in many protocols, a concentrated solution can be stored indefinitely at room temperature |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Sometimes referred to as MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 circle taper point 3-0 sutures | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (paraffin wax) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| p-Phenylenediamine | Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatin | Grocery Store | Commercial Knox gelatin works fine | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Gold Seal cover glass 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16-0.19 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | These coverslips are the recommended thickness for superresolution microscopy |
| Dumont forceps #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Paraffin oil (light) | EMD Chemicals | PX0047-1 | For isolating GVs in oil |
| Adhesive in situ PCR and hybridization chambers (25 µl). | BioRad | Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Silicone isolators | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Coplin jars and staining dishes | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
References
- Purkinje, J. E. . Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G. . Lampbrush Chromosomes. 36, (1986).
- Gall, J. G., Callan, H. G., Wu, Z., Murphy, C., Kay, B. K., Peng, H. B. Lampbrush chromosomes. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Vol. 36 Methods in Cell Biology , 149-166 (1991).
- Gall, J. G., Wu, Z. Examining the contents of isolated Xenopus germinal vesicles. Methods. 51, 45-51 (2010).
- Penrad-Mobayed, M., Kanhoush, R., Perrin, C. Tips and tricks for preparing lampbrush chromosome spreads from Xenopus tropicalis oocytes. Methods. 51, 37-44 (2010).
- Morgan, G. T. Working with oocyte nuclei: cytological preparations of active chromatin and nuclear bodies from amphibian germinal vesicles. Methods Mol. Biol. 463, 55-66 (2008).
- Paine, P. L., Johnson, M. E., Lau, Y. T., Tluczek, L. J., Miller, D. S. The oocyte nucleus isolated in oil retains in vivo structure and functions. Biotechniques. 13, 238-246 (1992).
- Handwerger, K. E., Cordero, J. A., Gall, J. G. Cajal bodies, nucleoli, and speckles in the Xenopus oocyte nucleus have a low-density, sponge-like structure. Mol Biol Cell. 16, 202-211 (2005).
- Patel, S., Novikova, N., Beenders, B., Austin, C., Bellini, M. Live images of RNA polymerase II transcription units. Chromosome Res. 16, 223-232 (2008).
- Gall, J. G. Octagonal nuclear pores. J Cell Biol. 32, 391-399 (1967).
- Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. J Cell Sci. 125, 570-575 (2012).
- Gottfert, F., et al. Coaligned dual-channel STED nanoscopy and molecular diffusion analysis at 20 nm resolution. Biophys J. 105, L01-L03 (2013).
- Wallace, R. A., Jared, D. W., Dumont, J. N., Sega, M. W. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes: III. Optimum incubation conditions. J. Exp. Zool. 184, 321-333 (1973).
- Bridger, J., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. Fluorescence in situhybridization to DNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111.111-111.136 (1998).
- Singer, R. H., Spector, D. L., Goldman, R. D., Leinwand, L. A. In situ hybridization to RNA. Cells: A Laboratory Manual. 3, 111-116 (1998).
- Gardner, E. J., Nizami, Z. F., Talbot, C. C., Gall, J. G. Stable intronic sequence RNA (sisRNA), a new class of noncoding RNA from the oocyte nucleus of Xenopus tropicalis. Genes Dev. 26, 2550-2559 (2012).
- Talhouarne, G. J., Gall, J. G. Lariat intronic RNAs in the cytoplasm of Xenopus tropicalis oocytes. RNA. 20, 1476-1487 (2014).
- Duryee, W. R. Isolation of nuclei and non-mitotic chromosome pairs from frog eggs. Arch. Exp. Zellforsch. 19, 171-176 (1937).
