Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em> Vermamoeba vermiformis</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
Die Isolierung von Riesen-Viren ist von großem Interesse in dieser neuen Ära der Virologie, vor allem, da diese riesigen Viren sind Protisten verwandt. Riesen Viren können potentiell pathogen sein für viele Arten von Protisten. Sie gehören zu den kürzlich beschriebenen Reihenfolge von Megavirales. Die neue Linie Faustovirus, die von Abwasserproben isoliert wurde, ist weitläufig verwandt mit dem Säuger-Erreger der Afrikanischen Schweinepest-Virus. Dieses Virus ist auch spezifisch für seine Amöben Wirt, Vermamoeba vermiformis, einem Protisten gemeinsam in Wassersystemen Gesundheitswesen. Es ist wichtig, neue Faustovirus Genotypen fortzusetzen, um die Isolierung ihres Genotyps Sammlung zu vergrößern und seine pan-Genom untersuchen. Wir entwickelten neue Strategien für die Isolierung von zusätzlichen Belastungen durch die Verwendung von Antibiotika und Antimykotika Kombinationen, um die Verbesserung der Bakterien- und Pilzkontaminationen der Amöbe Kokultur und begünstigen die Virusvermehrung zu vermeiden. Wir führten auch eine neue starvation Medium zu halten V. vermiformis unter optimalen Bedingungen für Viren Co-Kultur. Schließlich verwendeten wir Durchflusszytometrie statt mikroskopischen Beobachtung, die zeitaufwendig ist, den cytopathogenen Effekt zu erkennen. Wir erhielten zwei Isolate von Abwasserproben, die Effizienz dieses Verfahrens zu beweisen und damit die Verbreiterung der Sammlung von Faustoviruses, besser an ihre Umgebung zu verstehen, Wirtsspezifität und genetische Inhalt.
Introduction
Die Entdeckung des Riesen Viren, vor allem die Angehörigen der Megavirales Ordnung, völlig verändert die Welt der Viren in Bezug auf die Partikelgröße und Genom Komplexität. Die Viren wurden bisher angenommen , kleine Einheiten zu sein, und die Mimivirus erschienen , alle Regeln zu brechen. 1 metagenomische Daten , die die Allgegenwart von Riesen Viren nicht nur in der Umgebung vermuten lässt, 2-5 , sondern auch beim Menschen. 6 Daher besteht weiterhin ein Bedarf ist für diese Viren in großem Maßstab zu suchen. Die Vielfalt dieser riesigen Viren durch Abtasten nicht nur eine Vielzahl von Gewässern und die damit verbundenen Ablagerungen weltweit beurteilt wurde, 7-11 , sondern auch durch eine Vielzahl von humanen Proben 12,13 Screening und Umweltproben. 7,9 Die Acanthamoeba polyphaga Mimivirus war isoliert durch Co-Kultur phagozytischen Protisten verwenden, in erster Linie spp Acanthamoeba. 14-16 waren eine ganze Sammlung von Riesenviren dann auchisoliert von dieser angegebenen Protisten Host, die die wissenschaftliche Gemeinschaft ihre Forschungs- und Isolierungsverfahren für Acanthamoeba spp beschränken gemacht. Offensichtlich diese Abhängigkeit von einem einzigen Host-Spezies hat dazu geführt, ein großer Teil der Viren übersehen. Die Tatsache , dass der Riese Virus, CroV, mit dem hoch motile marine Einzeller Cafeteria Roenbergensis isoliert wurde, zeigt , 17,18 die Notwendigkeit , eine breitere Palette von Protozoen zu verwenden , um neue Linien oder Familien von Riesen-Viren zu entdecken. Reteno et al. Gelang andere Protozoen als Zellwirte auszuwählen , die nie benutzt worden war, und isoliert die neue Asfar bezogenen Linie von Riesenviren (die neu benannte Faustovirus). 19
In einem Versuch, neue Faustovirus Genotypen zu isolieren, um die Mitglieder dieser viralen Linie zu erweitern, modifizierten wir unsere Isolierungsverfahren und verwendet sie Umweltproben zum Screening der Lage, neue Faustoviruses Ernte. Wir danndas gesamte Protokoll beschrieben, um die neuen Isolate zu charakterisieren. Wir untersuchten Vermamoeba vermiformis, die am häufigsten Protisten freilebende in menschlichen Umgebungen gefunden, 20-22 , die bereits in der Isolierung des ersten Faustovirus Prototyp E12 verwendet wird. 19 Diese Protisten ist derzeit noch wirtsspezifisch für Faustovirus. Wir wussten, dass keines der bekannten Riesen Viren für diese Amöbe pathogen war, weil keine Versuche anderen Riesen Viren wachsen in unserem Labor Amöbe Lyse oder das virale Wachstum zeigte. Aus diesem Grund glauben wir , dass V. vermiformis ist die beste und einzigartige Zell Unterstützung bekannt zu neuen Faustoviruses isolieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Möglichkeit , dass Faustovirus schließen das erste Mitglied einer neuen Megavirales Familie ASFV zuerst von Reteno et al vorgeschlagen wurde sein könnte., 19 , aber einige Unterschiede noch unterschieden werden können. Es scheint unklar, ob Faustovirus die Asfarviridae Familie beitreten sollte oder ob es stattdessen eine neue vermeintliche Virusfamilie bilden. Dieses Problem wird weiter untersucht werden müssen, insbesondere eine umfassende Charakterisierung seiner Morphologie, Wirt…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
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