Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando<em> vermiformis Vermamoeba</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
O isolamento do vírus gigantes é de grande interesse nesta nova era de virologia, especialmente desde que estes vírus gigantes estão relacionados com protistas. vírus gigantes podem ser potencialmente patogênicos para muitas espécies de protistas. Eles pertencem à ordem descrita recentemente de Megavirales. A nova linhagem Faustovirus que foi isolado a partir de amostras de esgoto está distantemente relacionado com o agente patogénico de mamífero suíno Africano vírus da peste. Este vírus também é específico para o seu hospedeiro amébica, vermiformis Vermamoeba, um protista comuns em sistemas de água de cuidados de saúde. É crucial para continuar a isolar novos genótipos Faustovirus, a fim de ampliar sua coleção genótipo e estudar a sua pan-genoma. Nós desenvolvemos novas estratégias para o isolamento de estirpes adicionais, melhorando a utilização de combinações de antibióticos e antifúngicos, a fim de evitar as contaminações bacterianas e fúngicas da co-cultura ameba e favorecendo a multiplicação do vírus. Além disso, implementamos um novo starvation forma a manter V. vermiformis em condições óptimas para vírus co-cultura. Finalmente, utilizou-se citometria de fluxo em vez de observação microscópica, o que é moroso, para detectar o efeito citopatogénico. Obtivemos dois isolados de amostras de esgoto, comprovando a eficiência deste método e alargando, assim, a coleção de Faustoviruses, para entender melhor seu ambiente, especificidade do hospedeiro e conteúdo genético.
Introduction
A descoberta de vírus gigantes, especialmente aquelas que pertencem à ordem Megavirales, mudou completamente o mundo dos vírus em termos de tamanho de partícula e a complexidade do genoma. Os vírus foram previamente pensado para ser pequenas entidades, ea Mimivírus apareceu para quebrar todas as regras. 1 dados metagenômica sugere a ubiquidade dos vírus gigantes não só no ambiente, 2-5, mas também em seres humanos. 6 Portanto, ainda há uma necessidade de pesquisa para estes vírus em grande escala. A diversidade destes vírus gigantes foi avaliada por amostragem não só uma variedade de ambientes aquáticos e dos seus sedimentos associados em todo o mundo, 7-11, mas também por rastreio de uma variedade de amostras humanas 12,13 e amostras ambientais. Os 7,9 Mimivírus Polyphaga foi Acanthamoeba isolado por co-cultura utilizando protistas fagocíticas, principalmente Acanthamoeba spp. 14-16 Uma coleção inteira de vírus gigantes eram, então, tambémisolado a partir deste host protista especificado, o que fez a comunidade científica restringir o seu procedimento de pesquisa e isolamento de Acanthamoeba spp. É evidente que esta dependência de uma única espécie de hospedeiro resultou em uma grande fração de vírus que está sendo negligenciado. O fato de que o vírus gigante, CroV, foi isolado com o altamente móveis marinho roenbergensis protozoários Cafeteria, 17,18 demonstra a necessidade de usar uma ampla gama de protozoários, a fim de descobrir novas linhagens ou famílias de vírus gigantes. Reteno et al. Conseguiram selecionar outros protozoários como hospedeiros celulares que nunca tinha sido utilizado anteriormente, e isolado da nova linhagem relacionados com Asfar de vírus gigantes (o recém-nomeado Faustovirus). 19
Em uma tentativa para isolar novos genótipos Faustovirus a fim de expandir os membros desta linhagem viral, modificamos nossos procedimentos de isolamento e os usou para selecionar amostras ambientais capazes de colher novas Faustoviruses. Nós entãodescrito todo o protocolo para caracterizar os novos isolados. Foram avaliados vermiformis Vermamoeba, o protista de vida livre mais comum encontrado em ambientes humanos, 20-22 que já é utilizado no isolamento do primeiro protótipo Faustovirus E12. 19 Esta protista está ainda hospedar-específico para Faustovirus. Sabíamos que nenhum dos vírus gigantes conhecidos foi patogênico para esta ameba, porque nenhuma tentativa para crescer outros vírus gigantes em nosso laboratório mostraram lise ameba ou o crescimento viral. Por esta razão, nós acreditamos que V. vermiformis é o melhor e mais original suporte de células conhecidas para isolar novos Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
A possibilidade de que poderia ser Faustovirus o primeiro membro de uma nova família Megavirales perto de VPSA foi primeiro sugerida por Reteno et al., 19, mas algumas diferenças ainda pode ser distinguida. Parece claro se Faustovirus deve se juntar à família Asfarviridae ou se deve, em vez formar uma nova família viral putativo. Este problema vai exigir uma investigação mais aprofundada, em particular, uma caracterização mais abrangente de sua morfologia, gama de hospedeiros, o ciclo de rep…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
