Une stratégie rapide pour l'isolement des nouveaux Faustoviruses d'échantillons environnementaux Utilisation<em> vermiformis Vermamoeba</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
L'isolement des virus géants est d'un grand intérêt dans cette nouvelle ère de la virologie, d'autant plus que ces virus géants sont liés à des protistes. virus géants peuvent être potentiellement pathogènes pour de nombreuses espèces de protistes. Ils appartiennent à l'ordre des Megavirales récemment décrit. La nouvelle lignée Faustovirus qui a été isolé à partir d'échantillons d'eaux usées est lointainement apparenté au virus de la peste porcine africaine de l'agent pathogène de mammifère. Ce virus est également spécifique à son hôte amibienne, vermiformis Vermamoeba, un protiste commun dans les systèmes d'eau de soins de santé. Il est crucial de continuer à isoler de nouveaux génotypes Faustovirus afin d'élargir sa collection de génotype et étudier son pan-génome. Nous avons développé de nouvelles stratégies pour l'isolement de souches supplémentaires en améliorant l'utilisation de combinaisons d'antibiotiques et antifongiques, afin d'éviter les contaminations bactériennes et fongiques de la co-culture de l'amibe et de favoriser la multiplication du virus. Nous avons également mis en place un nouveau starvation moyen pour maintenir V. vermiformis dans des conditions optimales pour les virus co-culture. Enfin, nous avons utilisé la cytométrie en flux, plutôt que l'observation au microscope, ce qui prend du temps, afin de détecter l'effet cytopathogène. Nous avons obtenu deux isolats provenant d'échantillons d'eaux usées, ce qui prouve l'efficacité de cette méthode et élargissant ainsi la collection de Faustoviruses, afin de mieux comprendre leur environnement, la spécificité d'hôte et le contenu génétique.
Introduction
La découverte des virus géants, en particulier ceux appartenant à l'ordre Megavirales, a complètement changé le monde des virus en termes de taille des particules et de la complexité du génome. Les virus ont déjà été pensés pour être de petites entités, et l'Mimivirus semblaient briser toutes les règles. 1 données métagénomique suggère l'omniprésence des virus géants , non seulement dans l'environnement, 2-5 , mais aussi chez l' homme. 6 Par conséquent, il est encore nécessaire à la recherche de ces virus à grande échelle. La diversité de ces virus géants a été évaluée par échantillonnage non seulement une variété de milieux aquatiques et leurs sédiments associés dans le monde entier, 7-11 , mais aussi par criblage d' une variété d'échantillons humains 12,13 et les échantillons environnementaux. 7,9 Les mimivirus de polyphaga Acanthamoeba était isolé par co-culture en utilisant protistes phagocytaires, principalement Acanthamoeba spp. 14-16 toute une collection de virus géants étaient alors aussiisolé à partir de cet hôte de protistes spécifié, ce qui a rendu la communauté scientifique restreindre sa recherche et l' isolement procédure de Acanthamoeba spp. Il est clair que cette dépendance sur une seule espèce d'accueil a donné lieu à une grande partie des virus étant négligée. Le fait que le virus géant, CroV, a été isolé avec le très motiles marine protozoaires cafeteria roenbergensis, 17,18 démontre la nécessité d'utiliser une plus large gamme de protozoaires afin de découvrir de nouvelles lignées ou familles de virus géants. Reteno et al. A réussi à choisir d' autres protozoaires comme des cellules hôtes qui n'a jamais été utilisé auparavant, et isolé la nouvelle lignée Asfar liée des virus géants (le Faustovirus nouvellement nommé). 19
Dans une tentative d'isoler de nouveaux génotypes Faustovirus afin d'élargir les membres de cette lignée virale, nous avons modifié nos procédures d'isolement et les ont utilisés pour dépister les échantillons environnementaux capables de récolter de nouvelles Faustoviruses. Nous avons ensuitedécrit l'ensemble du protocole pour caractériser les nouveaux isolats. Nous avons évalué vermiformis Vermamoeba, le protistes vivant en liberté le plus répandu dans les environnements humains, 20-22 , qui est déjà utilisé dans l'isolement du premier prototype Faustovirus E12. 19 Cette protist actuellement encore l' hôte spécifique pour Faustovirus. Nous savions que aucun des virus géants connus était pathogène pour cette amibe, car aucune tentative de se développer d'autres virus géants dans notre laboratoire a montré une lyse amibe ou la croissance virale. Pour cette raison, nous croyons que V. vermiformis est le meilleur et le plus unique support cellulaire connue pour isoler de nouveaux Faustoviruses.
Protocol
Representative Results
Discussion
La possibilité que Faustovirus pourrait être le premier membre d'une nouvelle famille Megavirales près de ASFV a d' abord été suggérée par Reteno et al., 19 mais certaines différences peuvent encore se distinguer. Il semble difficile de savoir si Faustovirus devrait se joindre à la famille Asfarviridae ou si elle devrait plutôt former une nouvelle famille virale putative. Cette question nécessitera une enquête plus approfondie, notamment une caractérisation plus complète de sa m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
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