אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em> Vermiformis Vermamoeba</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
בידודו של וירוסים ענקים הוא עניין רב בעידן החדש הזה של וירולוגיה, במיוחד מאז וירוסים הענקים אלה קשורים הפרוטיסטים. וירוסים ענקים עשויים להיות פתוגניים פוטנציאליים עבור מינים רבים של הפרוטיסטים. הם שייכים הסדר המתואר לאחרונה Megavirales. השושלת החדשה Faustovirus כי כבר מבודד דגימות שפכים הוא קרוב רחוק של נגיף קדחת החזירים אפריקה יונקים הפתוגן. וירוס זה הוא גם ספציפי לאותו המחשב שלה amoebal, vermiformis Vermamoeba, לפרוטיסטים נפוצים במערכות מי בריאות. זה חיוני כדי להמשיך לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להגדיל אוסף גנוטיפ שלה וללמוד הפאן הגנום שלו. פתחנו אסטרטגיות חדשות עבור הבידוד של זנים נוספים על ידי שיפור שימוש שילובי אנטיביוטיקה נגד פטריות על מנת למנוע זיהומי חיידקים ופטריות של שיתוף תרבות האמבה ו לטובת כפל הווירוס. גם אנחנו יישמנו starvatio חדשn בינוני לשמור V. vermiformis בתנאים אופטימליים עבור וירוסים שיתוף תרבות. לבסוף, השתמשנו cytometry זרימה במקום תצפית מיקרוסקופית, וזה זמן רב, כדי לזהות את השפעת cytopathogenic. השגנו שני בידודים ממדגמים ביוב, להוכיח את היעילות של שיטה זו, ובכך להרחיב את אוסף Faustoviruses, כדי להבין טוב יותר את סביבתם, סגולי המארח תוכן גנטי.
Introduction
גילוי וירוסים ענקים, במיוחד אלה השייכים לסדר Megavirales, שינה לחלוטין את עולם הווירוסים מבחינת גודל חלקיקים ואת המורכבות הגנום. הווירוסים היו בעבר חשבו להיות ישויות קטנות, ואת Mimivirus הופיע לשבור את כל הכללים. 1 נתוני metagenomic מצביעים על ההמצאות בכל המקום של וירוסים ענקים לא רק בסביבה, 2-5 אלא גם בבני אדם. 6 לכן, יש עדיין צורך לחפש וירוסים אלה בקנה מידה גדול. המגוון של וירוסים הענקים אלה הוערך באמצעות דגימה לא רק במגוון סביבות מימיות ומשקעים הקשורים בם ברחבי העולם, 7-11 אלא גם על ידי הקרנת מגוון של דגימות אנושיות 12,13 ו דגימות סביבתיות. 7,9 mimivirus polyphaga Acanthamoeba היה מבודד על-ידי שיתוף התרבות באמצעות הפרוטיסטים phagocytic, spp Acanthamoeba בעיקר. 14-16 אוסף שלם של וירוסים ענקים היה אז גםשבודד מארח לפרוטיסטים שצוין זה, מה שהפך את הקהילה המדעית להגביל הליך מחקר בידודה עבור spp Acanthamoeba. ברור הסתמכות זו על זן לארח אחת הביאה חלק גדול של וירוסים מתעלמים ממנה. עובדת הווירוס הענק, CroV, היה מבודד עם roenbergensis קפיטריה פרוטוזואה הימי הניע מאוד, 17,18 ממחיש את הצורך להשתמש במגוון רחב יותר של פרוטוזואה על מנת לגלות שושלות חדשות או משפחות של וירוסים ענקים. Reteno et al. הצליח לבחור פרוטוזואה אחר כמארחי תא אשר מעולם לא נעשה בה שימוש בעבר, ומבודד את שושלת אספר הקשורות החדשה של וירוסים ענקים (את Faustovirus בשם החדש). 19
בניסיון לבודד גנוטיפים Faustovirus חדשים כדי להרחיב את חברי שושלת ויראלי זה, שינינו נהלי הבידוד שלנו והשתמשנו בם כדי להקרין דגימות סביבתיות מסוגלות קצירת Faustoviruses החדש. לאחר מכן, אנותאר את הפרוטוקול כולו לאפיין את הבידודים החדשים. החוקרים העריכו vermiformis Vermamoeba, את לפרוטיסטים חסרת חיים השכיח ביותר בקרב בסביבות האדם, 20-22 שכבר משמש את בידודה של אבטיפוס Faustovirus הראשון E12. 19 זה לפרוטיסטים כרגע עדיין לארח ספציפי עבור Faustovirus. ידענו שאף אחד הווירוסים הענקים הידועים היה פתוגניים עבור אמבה זה, כי אף ניסיונות לגדל וירוסים ענקים אחרים במעבדה שלנו הראתה תמוגה אמבה או צמיחת ויראלי. מסיבה זו, אנו מאמינים כי V. vermiformis היא התמיכה הסלולרית הטובה ביותר והייחודית ביותר הידועים לבודד Faustoviruses חדש.
Protocol
Representative Results
Discussion
האפשרות Faustovirus יכול להיות החבר הראשון של משפחה חדשה Megavirales קרוב ASFV הוצע לראשונה על ידי Reteno et al., 19 אבל כמה הבדלים עדיין ניתן להבחין. נראה ברור אם Faustovirus צריך להצטרף למשפחת Asfarviridae או שמא במקום ליצור משפחה ויראלי המשוערת חדש. בעיה זו תדרוש חקירה נוספת, בפרט אפיו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
