Een snelle strategie voor de isolatie van nieuwe Faustoviruses van milieumonsters gebruiken<em> Vermamoeba vermiformis</em
Summary
We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.
Abstract
De isolatie van reusachtige virussen is van groot belang in dit nieuwe tijdperk van virologie, vooral omdat deze reusachtige virussen worden gerelateerd aan protists. Giant virussen kunnen potentieel pathogene voor vele soorten van protisten zijn. Ze behoren tot de onlangs beschreven volgorde van Megavirales. De nieuwe lijn Faustovirus dat is geïsoleerd uit rioolwater monsters is ver verwant aan de zoogdieren pathogeen virus van Afrikaanse varkenspest. Dit virus is ook specifiek voor de amoebal gastheer, Vermamoeba vermiformis, een protist gebruikelijk in de gezondheidszorg watersystemen. Het is van cruciaal belang om te blijven isoleren van nieuwe Faustovirus genotypes om de genotype collectie te vergroten en te bestuderen zijn pan-genoom. We ontwikkelden nieuwe strategieën voor het isoleren van aanvullende stammen door een beter gebruik van antibiotica en antifungale combinaties om bacteriële en fungale verontreiniging van de amoebe co-kweek te voorkomen en het bevorderen van de virusvermenigvuldiging. We hebben ook geïmplementeerd een nieuw starvation middellange tot V. behouden vermiformis in optimale omstandigheden voor virussen co-cultuur. Uiteindelijk, met flowcytometrie plaats van microscopische waarneming, hetgeen tijdrovend, het cytopathogene effect detecteren. We kregen twee isolaten uit rioolwater monsters waaruit de efficiëntie van deze werkwijze en daarmee de verbreding verzameling Faustoviruses, beter te begrijpen hun omgeving gastheerspecificiteit en genetische inhoud.
Introduction
De ontdekking van gigantische virussen, in het bijzonder die welke behoren tot de Megavirales orde, compleet veranderde de wereld van virussen in termen van deeltjesgrootte en genoom complexiteit. Virussen werden eerder gedacht kleine entiteiten en de mimivirus bleek alle regels overtreden. 1 Metagenomic gegevens suggereren de alomtegenwoordigheid van grote virussen niet alleen in het milieu, 2-5 maar ook bij mensen. 6 Derhalve bestaat er nog steeds behoefte zoeken naar deze virussen op grote schaal. De diversiteit van deze reusachtige virussen werd bepaald door middel van steekproeven niet alleen een verscheidenheid van het aquatisch milieu en de bijbehorende sedimenten wereldwijd, 7-11, maar ook door het screenen van een verscheidenheid van menselijke monsters 12,13 en milieu monsters. 7,9 de Acanthamoeba polyphaga mimivirus was geïsoleerd door middel van co-cultuur met behulp van fagocytische protisten, voornamelijk Acanthamoeba spp. 14-16 Een hele collectie van reuze virussen waren dan ookgeïsoleerd uit dit gespecificeerde protist gastheer, waardoor de wetenschappelijke gemeenschap haar onderzoek en isolatie procedure voor Acanthamoeba spp beperken. Dit duidelijk afhankelijkheid van één gastheersoort heeft geleid tot een groot deel virussen het hoofd gezien. Dat de reus virus, CroV, werd geïsoleerd met de zeer beweeglijke Zeewaterprotozoa cafetaria roenbergensis, 17,18 aantoont dat een breder scala van protozoa gebruiken om nieuwe geslachten of families van grote virussen ontdekt. Reteno et al. Heeft andere protozoa als gastheercellen die nooit eerder werd gebruikt selecteren en die de nieuwe Asfar gerelateerde lijn van grote virussen (de nieuwe naam Faustovirus). 19
In een poging om nieuwe Faustovirus genotypes isoleren om de leden van deze virale stam breiden wij onze gemodificeerde isolatieprocedures en gebruikten ze om monsters milieu kunnen oogsten nieuwe Faustoviruses screenen. Wij danbeschreef de gehele protocol bij de nieuwe isolaten karakteriseren. Onderzochten we Vermamoeba vermiformis, de meest voorkomende vrijlevende protist in menselijke omgevingen 20-22 reeds bij het isoleren van de eerste Faustovirus prototype E12. 19 Dit protist is nog steeds gastheerspecifiek voor Faustovirus gebruikt. We wisten dat geen van de bekende reus virussen pathogeen was voor deze amoebe, omdat er geen pogingen groeien andere grote virussen in ons laboratorium toonden amoebe lysis of virale groei. Om deze reden zijn wij van mening dat V. vermiformis is de beste en meest unieke Celdrager bekend om nieuwe Faustoviruses isoleren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mogelijkheid dat Faustovirus het eerste lid van een nieuwe familie Megavirales nabij ASFV kon werd eerst door Reteno et al., 19 maar verschillen nog te onderscheiden. Het lijkt onduidelijk of Faustovirus moet toetreden tot de familie Asfarviridae of dat het in plaats daarvan zou moeten vormen van een nieuw vermeende virale familie. Deze kwestie zal verder onderzoek, in het bijzonder een uitgebreidere karakterisering van de morfologie, gastheer range, replicatiecyclus en gen repertoire vereisen. Me…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements to make.
Materials
| LSR FORTESSA cytometer | BD Biosciences | France | 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Germany | 5027/11 |
| Optical inverted microscope | leica | France | 72643 |
| DNA extraction | Qiagen EZ1 Advanced XL Extraction Robot | France | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | France | 785BR06298 |
| PYG medium , PAS, Starvation medium | In house laboratory production | Marseille URMITE | x |
| Amoeba strain CDC-19 | ATCC | France | 50237 |
| Plates | Cellstar | France | 655180 |
| PCR materials, primers. | eurogentec | France | Primers cited in manuscript |
| glasstic slide 10 with grids | Kova | USA | H899871441F |
| Eosin/ blue Azur-Hemacolor stain | Merck milipore | France | 111955,6,57,109468 |
| Vacuum driven filters | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Phosphate-Buffered Saline | Thermo Fisher scientific | France | 10010-023 |
| DAPI stain | Life Technologies | France | D1306 |
| cytospin 4 cytocentrifuge | Thermo Fisher scientific | France | 10522013JT184-31 |
| Single cytology tunnel | Biomedical polymers inc. | France | BMP-cyto-S50 |
| Carbon grids | Euromedex | France | FCF400NI |
| Ammonium molibdate | VWR internationanl | France | 21276185 |
| Flasks | SARSTEDT | Germany | 833911 |
| 0.22μm filters | Milex millipor | France | SE2M229104 |
| Ultracentrifuge Sorval WX 80 | Thermo scientific | France | 9102448 |
| Rapid-flow filters | Nalgene | France | 450-0020 |
References
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -. M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al. Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses. Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).
- Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea. Genome Biol. , (2008).
- Claverie, J. -. M., et al. Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges. J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).
- Colson, P., et al. Evidence of the megavirome in humans. J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).
- La Scola, B., et al. Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry. Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ Microbiol. , (2012).
- Pagnier, I., et al. A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba. Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. PNAS. , (2014).
- Saadi, H., et al. First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia. Clin Infect Dis. , (2013).
- Saadi, H., et al. Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia. Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses. Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).
- Colson, P., et al. Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes. Genome Biol Evol. 3, 737-742 (2010).
- Claverie, J. -. M., Abergel, C. Open questions about giant viruses. Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).
- Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Van Etten, J. L. Another really, really big virus. Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. J.Virol. , (2015).
- Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey. Biomed res Int. 2013, 675145 (2013).
- Bradbury, R. S. Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture. J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).
- Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water. Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).
- Ogata, H., Toyoda, K., et al. Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus. Virol J. 6, 178-178 (2008).
- Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama. Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).
