العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات
Summary
There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.
Abstract
الأمعاء – والتي تحتوي على أكبر عدد من الخلايا المناعية من أي جهاز في الجسم – تتعرض باستمرار لمستضدات أجنبية، سواء الميكروبية والغذائية. نظرا فهم متزايد بأن هذه المضادات اللمعية تساعد في تشكيل استجابة مناعية وأن التعليم من الخلايا المناعية داخل الأمعاء أمر بالغ الأهمية لعدد من الأمراض الجهازية، هناك اهتمام متزايد في وصف نظام المناعة في الأمعاء. ومع ذلك، العديد من البروتوكولات المنشورة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. نقدم هنا بروتوكول مبسط لعزل الخلايا الليمفاوية من المخصوصة صغيرة في الأمعاء الصفيحة، طبقة داخل الظهاري، وبقع باير، على أن يكون سريع ومفيد، ولا يتطلب التدرجات Percoll شاقة. على الرغم من أن البروتوكول يركز على الأمعاء الدقيقة، بل هو أيضا مناسبة لتحليل القولون. وعلاوة على ذلك، فإننا نسلط الضوء على بعض الجوانب التي قد تحتاج إلى التحسين إضافية تبعا لسؤال كان علمي محددنشوئها. وقد أدى هذا النهج في عزل أعداد كبيرة من الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة التي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لتحليل تدفق cytometric أو وسائل بديلة لالتوصيف.
Introduction
وغالبا ما تعتبر المهمة الرئيسية من الأمعاء الدقيقة لتكون عملية الهضم وامتصاص المواد الغذائية 1. في حين أن هذا ظيفة التمثيل الغذائي أمر ضروري بشكل واضح، والأمعاء الدقيقة لديه دورا هاما على قدم المساواة في حماية المضيف من وابل متواصل من المضادات البيئية الموجودة داخل التجويف 2. الأمعاء يفصل بين العالم الخارجي (على سبيل المثال، المضادات اللمعية) من البيئة الداخلية للمضيف مع طبقة الظهارية التي ليست سوى طبقة خلية واحدة سميكة. على هذا النحو، والجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء لديه مهمة هائلة من موازنة عتبته للتفاعل، مما يسمح المستضدات الأجنبية من النظام الغذائي والمتعايشة الميكروبات لدخول الغشاء المخاطي مع الحد الأدنى، إن وجدت، استجابة مناعية بينما تصاعد ردا قويا ضد غزو الجراثيم و غيرها من مستضدات "الضارة". الاستجابات المناعية المفرطة أو غير لائقة لهذه المستضدات يمكن أن يؤدي إلى مرض مرضية (على سبيل المثال، inflammaمرض المحافظين الأمعاء، نوع الأول من مرض السكري، والتصلب المتعدد) ويجب تجنب 3-6.
وبشكل عام، يعتقد أن الجهاز الهضمي لتمثيل أكبر جهاز المناعة في الجسم، وتحتوي على أكثر من 70٪ من جميع الخلايا المفرزة للأجسام المضادة 7. ويتكون الجهاز المناعي الصغيرة الأمعاء من 3 المقصورات الرئيسية – الصفيحة المخصوصة (LP)، وطبقة داخل الظهاري، وبقع باير ل(PPS) – أن كل يحتوي على مجموعة مميزة من الخلايا الليمفاوية 2. الخلايا اللمفية ليرة لبنانية (LPLs) هي في المقام الأول خلايا TCRαβ + T مع ~ الخلايا البائية 20٪. الخلايا الليمفاوية داخل الظهاري (IELs) تحتوي على عدد قليل جدا من الخلايا البائية مع المزيد من الخلايا TCRγδ + T من الخلايا TCRαβ + T. وذكر المكتب الصحفى، وهما جهازان اللمفاوية الثانوية جزءا لا يتجزأ من جدار الأمعاء الصغيرة، تحتوي على حوالي 80٪ الخلايا البائية. على الرغم من أن كل من هذه المناطق التشريحية وظائف متميزة قليلا والقواعد وجودي، أنها تعمل في آهالأزياء armonized لحماية المضيف من الشتائم المسببة للأمراض.
وعلاوة على ذلك، هناك إدراك متزايد بأن الجراثيم عامل حاسم لتطوير نظام المناعة في الأمعاء، مع زيادة الاعتراف علاقة المشابهة بين الميكروبات محددة وتطور الجنين معينة الأنساب الخلية 8،9. وعلاوة على ذلك، بالنظر إلى أن التعليم من نظام المناعة في الأمعاء يؤثر على الاستجابات المناعية في مواقع بعيدة تشريحيا (على سبيل المثال، التهاب المفاصل، والتصلب المتعدد، والتهاب رئوي)، أصبح من الواضح أن تطوير نظام المناعة المعوية هي ذات الصلة لمزيد من عمليات المرض مما هو معروف في السابق 10 -12. على هذا النحو، وقد امتد الاهتمام تقييم كمي لجهاز المناعة المعوية وراء التفاعلات المضيف الممرض لتشمل الآن التفاعلات المضيف المتعايشة والتسبب في العديد من الأمراض الجهازية كذلك.
ونظرا لتنوع الأساليب المتبعة حاليا فيعزل الخلايا الليمفاوية المعوية، وهو الأسلوب الذي هو الأمثل لالعائد، والسلامة، والاتساق حين تحقيق التوازن بين الوقت المطلوب أمر بالغ الأهمية على نحو متزايد. البروتوكولات التي تنطوي على التدرجات Percoll هي الوقت والعمل المكثف ويحتمل أن تكون أكثر عرضة للخطأ البشري، مما أدى إلى العائد المتغير وقدرتها على البقاء 13. هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لعزل وتوصيف الخلايا الليمفاوية من جميع المقصورات المناعة الصغيرة المعوية 3. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لتزايد الاهتمام في التعديلات التي يسببها ميكروب في الجهاز المناعي المخاطي، ندرج الخطوات التي يمكن أن تستخدم للسماح لنقل أفقي من الكائنات الحية الدقيقة بين الفئران لتقييم مدى تؤثر هذه التغييرات على الكمية جهاز المناعة المعوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم بروتوكول لعزل وتوصيف تدفق cytometric من الخلايا الليمفاوية الصغيرة الأمعاء، بما في ذلك LPLs، IELs، والخلايا الليمفاوية في ذكر المكتب الصحفى. للراغبين في تقييم كيف يمكن للتغييرات في الجراثيم التي تؤثر على نظام المناعة الصغيرة الأمعاء، ونحن بالتفصيل الخطوات واضحة المشا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NKS is supported by NIH award K08 AI108690.
Materials
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| stir bar | VWR | 58949-062 | |
| multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 96-well plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (optional) fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
References
- Cummings, D. E., Overduin, J. Gastrointestinal regulation of food intake. J Clin Invest. 117 (1), 13-23 (2007).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14 (10), 667-685 (2014).
- Round, J. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota shapes intestinal immune responses during health and disease. Nat Rev Immunol. 9 (5), 313-323 (2009).
- Sartor, R. B. Microbial influences in inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 134 (2), 577-594 (2008).
- Tlaskalova-Hogenova, H., et al. Commensal bacteria (normal microflora), mucosal immunity and chronic inflammatory and autoimmune diseases. Immunol Lett. 93 (2-3), 97-108 (2004).
- Wen, L., et al. Innate immunity and intestinal microbiota in the development of Type 1 diabetes. Nature. 455 (7216), 1109-1113 (2008).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue distribution of lymphocytes and plasma cells and the role of the gut. Trends Immunol. 29 (5), 206-208 (2008).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. The yin yang of bacterial polysaccharides: lessons learned from B. fragilis PSA. Immunol Rev. 245 (1), 13-26 (2012).
- Surana, N. K., Kasper, D. L. Deciphering the tete-a-tete between the microbiota and the immune system. J Clin Invest. 124 (10), 4197-4203 (2014).
- Gauguet, S., et al. Intestinal microbiota of mice influences resistance to Staphylococcus aureus pneumonia. Infect Immun. , (2015).
- Ochoa-Reparaz, J., et al. A polysaccharide from the human commensal Bacteroides fragilis protects against CNS demyelinating disease. Mucosal Immunol. 3 (5), 487-495 (2010).
- Wu, H. J., et al. Gut-residing segmented filamentous bacteria drive autoimmune arthritis via T helper 17 cells. Immunity. 32 (6), 815-827 (2010).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Chung, H., et al. Gut immune maturation depends on colonization with a host-specific microbiota. Cell. 149 (7), 1578-1593 (2012).
- Resendiz-Albor, A. A., Esquivel, R., Lopez-Revilla, R., Verdin, L., Moreno-Fierros, L. Striking phenotypic and functional differences in lamina propria lymphocytes from the large and small intestine of mice. Life Sci. 76 (24), 2783-2803 (2005).
- Carrasco, A., et al. Comparison of lymphocyte isolation methods for endoscopic biopsy specimens from the colonic mucosa. J Immunol Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
