L'isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l'intestin grêle Lymphocytes murine
Summary
There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.
Abstract
Les intestins – qui contiennent le plus grand nombre de cellules immunitaires de tout organe dans le corps – sont constamment exposés à des antigènes étrangers, à la fois microbienne et alimentaire. Compte tenu de la compréhension croissante que ces antigènes luminal contribuent à façonner la réponse immunitaire et que l'éducation des cellules immunitaires dans l'intestin est critique pour un certain nombre de maladies systémiques, on a accru l'intérêt pour la caractérisation du système immunitaire intestinal. Cependant, de nombreux protocoles publiés sont laborieux et prend du temps. Nous présentons ici un protocole simplifié pour l'isolement de lymphocytes à partir propria de l'intestin grêle lamina couche intraépithéliales et les plaques de Peyer qui est rapide, reproductible et ne nécessite pas de gradients de Percoll laborieux. Bien que le protocole met l'accent sur l'intestin grêle, il est également adapté à l'analyse du côlon. De plus, nous mettons en évidence certains aspects qui peuvent avoir besoin d'optimisation supplémentaires en fonction de la ques scientifique spécifiquetion. Cette approche se traduit par l'isolement d'un grand nombre de lymphocytes viables qui peuvent ensuite être utilisés pour l'analyse par cytométrie de flux ou d'autres moyens de caractérisation.
Introduction
La tâche principale de l'intestin grêle est souvent considérée comme la digestion et l' absorption des nutriments 1. Bien que cette fonction métabolique est évidemment essentiel, de l'intestin grêle a un rôle tout aussi important dans la protection de l'hôte à partir du barrage continu des antigènes environnementaux trouvés dans la lumière 2. Le tractus intestinal sépare le monde extérieur (par exemple., Antigènes luminal) à partir de l'environnement interne de l'hôte avec une couche épithéliale qui est seulement une couche cellulaire unique épaisse. En tant que tel, le système immunitaire de l'intestin grêle a la formidable tâche d'équilibrer son seuil pour la réactivité, ce qui permet des antigènes étrangers provenant de l'alimentation et commensaux microbes d'entrer dans la muqueuse avec un minimum, le cas échéant, la réponse immunitaire lors du montage d'une réponse robuste contre les agents pathogènes envahisseurs et d'autres antigènes "nuisibles". Réponses immunitaires excessives ou inappropriées à ces antigènes peuvent conduire à une maladie pathologique (par exemple., Inflammamaladie tory de l' intestin, diabète de type I, la sclérose en plaques) et doit être évitée 3-6.
Dans l' ensemble, le tractus gastro – intestinal est considéré comme représentant le plus grand organe immunitaire dans le corps, contenant plus de 70% de toutes les cellules sécrétrices d'anticorps 7. Le système immunitaire de l' intestin grêle est composé de 3 compartiments principaux – la lamina propria (LP), la couche intraépithéliale, et les plaques de Peyer (PP) – que chacun contient un groupe distinctif de lymphocytes 2. Les lymphocytes LP (LPLs) sont principalement des cellules avec des cellules ~ 20% B TCRap + T; lymphocytes intraépithéliaux (LIE) contiennent très peu de cellules B avec plus de cellules TCRγδ + T que les cellules TCRap + T; et PPs, qui sont les organes lymphoïdes secondaires embarqués dans le petit-intestinal mur, contiennent ~ 80% de cellules B. Bien que chacune de ces régions anatomiques a des fonctions légèrement distinctes et les bases ontologiques, ils fonctionner dans ahla mode armonized pour protéger l'hôte contre les insultes pathogènes.
En outre, il est de plus en plus l' appréciation que le microbiote est un facteur déterminant pour le développement du système immunitaire intestinal, avec l' augmentation de la reconnaissance de la relation entre les microbes spécifiques apparenté et l'ontogenèse des particuliers lignées cellulaires 8,9. En outre, étant donné que l' éducation du système immunitaire intestinal affecte les réponses immunitaires dans des sites anatomiquement éloignés (par exemple., L' arthrite, la sclérose en plaques, la pneumonie), il est devenu clair que le développement du système immunitaire intestinal est pertinent pour plus de processus de la maladie que précédemment reconnu 10 -12. En tant que tel, l'intérêt pour l'évaluation quantitative du système immunitaire intestinal a étendu au-delà des interactions hôte-pathogène pour inclure désormais les interactions hôte-commensal et la pathogenèse de nombreuses maladies systémiques ainsi.
Compte tenu de la variabilité des méthodes actuelles dans leisolement des lymphocytes intestinaux, un procédé qui est optimisé pour le rendement, de la viabilité et l'uniformité tout en équilibrant le temps nécessaire est de plus en plus critique. Les protocoles qui impliquent des gradients de Percoll sont le temps et de main – d'œuvre et potentiellement plus sujettes à l' erreur humaine, conduisant à un rendement variable et la viabilité 13. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l'isolement et la caractérisation des lymphocytes de tous les compartiments 3 immunitaire de l'intestin grêle. De plus, l'intérêt croissant porté par des altérations induites par les microbes dans le système immunitaire des muqueuses, on comprend les étapes qui peuvent être utilisés pour permettre la transmission horizontale des micro-organismes entre la souris pour évaluer la façon dont ces modifications affectent quantitativement le système immunitaire intestinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons un protocole pour l'isolement et le flux de caractérisation cytométrie de petits lymphocytes-intestinaux, y compris le LPLs, IELs, et les lymphocytes dans le PPs. Pour ceux intéressés à évaluer comment les changements dans le microbiote affectent le système immunitaire de l'intestin grêle, nous détaillons les étapes simples impliqués dans la transmission horizontale des organismes entre les souris hébergeant différentes microbiotes. Bien que ce protocole se concentre sur l'intes…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NKS is supported by NIH award K08 AI108690.
Materials
| Sterile Gloves | Kimberly-Clark | 555092 | |
| sterile mouse cage | Innovive | MS2-AD | contains lid, cage bottom, and alpha-dri bedding |
| metal feeder | Innovive | M-FEED | |
| water bottle | Innovive | M-WB-300 | |
| card holder | Innovive | CRD-HLD-H | |
| autoclavable rodent chow (NIH-31M) | Zeigler | 4131207530 | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | 11875-119 | |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Ambion | AM9262 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GemBio | 100-510 | |
| dispase II | Invitrogen | 17105-041 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 1.878 U/mg |
| collagenase, type II | Invitrogen | 17101-015 | the concentration in the protocol is based on an activity level of 245 U/mg |
| dissecting scissors | Roboz | RS-5882 | |
| feeding needle (18 G, 2" length) | Roboz | FN-7905 | |
| 10 ml syringe | BD | 305482 | |
| PBS | Gibco | 14190-250 | |
| Disposable Scalpel (15 blade) | Miltex | 4-415 | |
| curved forceps | Roboz | RS-5211 | |
| straight forceps | Roboz | RS-5132 | |
| multi-purpose cups, 120 ml | VWR | 89009-662 | |
| stir bar | VWR | 58949-062 | |
| multi-position stir plate, 9-position | VWR | 12621-048 | |
| stainless steel conical strainer, 3 inch | RSVP | ||
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 100 μm cell strainer | Falcon | 08-771-19 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 08-771-1 | |
| 50 mL conical tube | Falcon | 352098 | |
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 96-well plate, round-bottom | Corning | 3799 | |
| anti-mouse CD16/32 (Fc block) | Biolegend | 101320 | |
| (optional) fixable viability dye eFluor 780 | eBiosciences | 65-0865-18 | |
| 10% formalin, neutral buffered | Thermo Scientific | 5725 |
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