Optimale Lentivirus Produktion und Zellkulturbedingungen notwendig für eine erfolgreiche transduzieren primären humanen bronchialen Epithelzellen
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
In – vitro – Kultur von primären humanen bronchialen Epithelzellen (HBE) Zellen unter Verwendung von Luft-Flüssigkeit – Grenzfläche Bedingungen ein nützliches Modell stellt die Prozesse der Atemwegszelldifferenzierung und Funktion zu untersuchen. In den letzten Jahren wurde die Verwendung von lentiviralen Vektoren für die Transgen Lieferung gängige Praxis. Während es Berichte über Transduktion von vollständig differenzierten Epithelzellen der Atemwege mit bestimmten nicht-HIV pseudo-typisierten Lentiviren sind, ist die Gesamt Transduktionseffizienz in der Regel weniger als 15%. Das Protokoll vorgestellt hier stellt eine zuverlässige und effiziente Methode Lentiviren zu produzieren und primären humanen bronchialen Epithelzellen zu transduzieren. Verwendung undifferenzierter bronchialen Epithelzellen, Transduktion in bronchial epithelial Wachstumsmedien, während die Zellen anschließen, mit einer Multiplizität der Infektion Faktor 4 stellt Wirkungsgrade nahe 100%. Dieses Protokoll beschreibt, Schritt-für-Schritt, der Herstellung und der Konzentration von hohem Titer lentiviralen Vektoren und the Transduktionsprozesses. Es werden die Experimente, die die optimalen Kulturbedingungen bestimmt hocheffiziente Transduktionen von primären humanen bronchialen Epithelzellen erreichen.
Introduction
Die Entwicklung von replikationsdefektiven, pseudotypisiertem Lentiviren (LV) hat mit einem sicheren und effizienten Methode Forscher bereitgestellt Transgenen in vitro 1 zu liefern. Aufgrund ihrer langfristigen Expression könnte diese LV auch für die Abgabe von therapeutischen Mitteln in vivo 2,3 verwendet werden. Die Herstellung von LV erfordert die Cotransfektion von menschlichen embryonalen Nieren (HEK – Zellen) mit verschiedenen Plasmiden: Transfervektor, Verpackungs gag / pol, rev Verpackung und umhüllen vesikulären Stomatitis – Virus – Glycoprotein (VSV-G) Plasmiden. Die dritte Generation der Verpackungssysteme sind als sicherer als Systeme der zweiten Generation , weil die rev – Gen auf einem separaten Verpackung Plasmid codiert wird, wodurch die Möglichkeit der Rekombination Reduzieren eines Replikations – kompetenten Lentiviren zu erzeugen. Obwohl der zweiten Generation Verpackungssysteme fünffach höhere Gesamtübertragungseinheiten ergeben, auf die Spaltung des ursprünglichen viralen Genoms erstellendas System der dritten Generation hat sich nur minimal 3,4 die Höhe der Übertragungs verringert.
Während Zelllinien können einfacher und effizienter transduziert werden, haben Forscher ihren Fokus auf Primärzellen verschoben werden , da diese mehr repräsentativ für in vivo 5,6 Geweben. Allerdings sind Primärzellen refraktär Transduction. Während Transduktion von Epithelzellen der Atemwege ausdifferenzierten berichtet hat der Gesamtwirkungsgrad 15% 7 nicht überschritten wird .
Hier beschrieben ist ein Protokoll, das die Produktion von LVs mit hohem Titer ermöglicht. Ein Schritt-für-Schritt-Ansatz skizziert nahezu 100% Transduktionseffizienz in primäre HBE-Zellen zu erreichen. Genauer gesagt beschreibt das Protokoll , um die optimalen Kulturbedingungen instrumental 3 erfolgreich zu sein. Kurz gesagt, werden HEK 293T-Zellen-Promotor die Expression von enhanced green fluorescent mit dem lentiviralen Expressionsvektor pcdh mit dem EF-1 transfiziertProtein (eGFP) oder mCherry, ein rot fluoreszierendes Protein und ein Verpackungssystem der dritten Generation. LVs in den Medien veröffentlicht werden 24 bis 72 Stunden später gesammelt. Die Viruspartikel mit Polyethylenglykol (PEG) konzentriert, eine bequeme und einfache Methode der viralen Konzentration vor Titer Schätzungs ein p24-Antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Kit. Anschließend werden undifferenzierte primäre HBE – Zellen in Proliferationsmedium (bronchiale epitheliale Wachstumsmedium oder BEGM) transduziert 8, während Anbringen (nach trypsiniert wird), bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) Faktor 4, Hexadimethrinbromid Zugabe und für 16 Stunden inkubiert ( über Nacht). Die Zellen werden dann zu differenzieren gelassen. Da die virale Transgen langfristig (unter Verwendung des geeigneten Promotor, siehe Diskussion) ausgedrückt wird, wird die Expression im gesamten Differenzierung in einem mehrreihigen Luftwegsepithel gehalten werden oder kann (unter Verwendung eines induzierbaren Promotors) nach der Differenzierung induziert werden.
<p class = "jove_content"> Dieses Protokoll ist von großem Interesse für Forscher, die anstelle von Zelllinien, primären HBE-Zellen verwendet werden soll, und könnte auf andere schwer anpassbar sein Zelltypen zu transduzieren.Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll hier skizzierte sichert zu 100% Transduktionseffizienzen schließen. Allerdings gibt es Schritte während des Prozesses, sind wichtig, dieses Ziel zu erreichen. Zum Beispiel während der Transfektionsprozess das Vorhandensein von Präzipitaten in der Transduktion mix (drop) oder in der Schale am Tag nach der Transduktion (Figuren 1b und d) sind sowohl relevant für eine gute Transfektion. Das Fehlen eines Niederschlag oder das Vorhandensein von Agglomeraten zu einer Auslas…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Leben Allianz Organ Recovery-Agentur von der University of Miami für Lungen bieten. Wir danken auch Dr. Lisa Künzi für die DNA-Präparation für die Experimente in 2B gezeigt ist, verwendet und 3-D, Dr. Ben Gerovac und Lisa Novak für die mCherry Virus für die Versuche in den 3A bis C verwendet Wir danken auch Gabriel Gaidosh von der Abbildungseinrichtung, Department of Ophthalmology an der Universität von Miami.
Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, der CF-Stiftung und der Flight Attendant Medical Research Institute an Dr. Matthias Salathe gefördert.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
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