אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
בתרבות במבחנה של אפיתל הסימפונות אדם מן המעלה הראשונה (HBE) תאים באמצעות תנאים ממשק אוויר נוזלי מספקת מודל שימושי כדי לחקור את התהליכים של התמיינות תאים בדרכי הנשימה ותפקוד. בשנים האחרונות, השימוש וקטורים lentiviral למסירה transgene הפך לנוהל קבוע. אמנם ישנם דיווחים על התמרה של תאי אפיתל דרכי נשימת בדיל באופן מלא עם lentiviruses פסאודו הקלדה מסוים ללא HIV, את יעילות התמרה הכללית היא בדרך כלל פחות מ -15%. הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה אמינה ויעילה לייצר lentiviruses וכדי transduce תאי אפיתל סימפונות אדם מן המעלה ראשונה. שימוש בתאי אפיתל סימפונות מובחנים, התמרו בתקשורת צמיחת אפיתל סימפונות, בעוד התאים לצרף, עם ריבוי של גורם זיהום של 4 מספק יעילות קרובה ל -100%. פרוטוקול זה מתאר, צעד-אחר-צעד, ההכנה וריכוז וקטורי lentiviral גבוהה כיילו ו התהליך התמרת דואר. הוא דן ניסויים אשר קבעו את תנאי התרבות האופטימליים להשגת transductions היעילה ביותר של תאי אפיתל סימפונות אדם מן המעלה הראשון.
Introduction
פיתוח שכפול פגום, lentiviruses Pseudotyped (LV) סיפקה לחוקרים שיטה בטוחה ויעילה כדי לספק transgenes במבחנה 1. בשל הביטוי שלהם לטווח הארוך, LV אלה יכולים לשמש גם עבור המשלוח ממוקד של תרופות in vivo 2,3. ההפקה של LV דורשת שיתוף transfection של כליה עוברית אנושית (HEK) תאים עם כמה פלסמידים: העברת וקטור, איסור פרסום אריזה / pol, rev אריזה, ומעטפת גליקופרוטאין וירוס stomatitis שלפוחי (VSV-G) פלסמידים. מערכות אריזת דור שלישי נחשבים בטוחים יותר מאשר מערכות דור השני בגלל גן rev מקודד על פלסמיד אריזה נפרד, ובכך להפחית את האפשרות של רקומבינציה לייצר lentivirus שכפול מוסמכות. בעוד שמערכות אריזת דור השני להניב חמש יחידות תמרה הכולל גבוהות פי, הפיצול של הגנום הויראלי המקורי כדי ליצורמערכת הדור השלישי ירד לרמה של תמרה רק 3,4 מינימאלית.
בעוד שורות תאים ניתן transduced יותר בקלות וביעילות, חוקרים הסיט את המוקד שלהם תאים ראשוניים, כי אלה הם יותר נציג in vivo רקמות 5,6. עם זאת, תאים ראשוניים הם עקשנים תמרה. בעוד התמרה של תאים בדרכי הנשימה אפיתל הבדיל באופן מלא דווחו, את היעילות הכוללת כאמור לא עלתה על 15% 7.
המתואר כאן הוא פרוטוקול המאפשר ייצור של LVS גבוהה כייל. גישה צעד-אחר-צעד המתואר להשיג כמעט 100% יעילות התמרה לתאים HBE העיקרי. באופן ספציפי יותר, הפרוטוקול מתאר את תנאי התרבות האופטימליים אינסטרומנטלי להצליח 3. בקצרה, תאי 293T HEK הם transfected באמצעות pCDH וקטור ביטוי lentiviral עם ביטוי נהיגת האמרגן EF-1 של פלואורסצנטי ירוק משופר חלבון (eGFP) או mCherry, חלבון פלואורסצנטי אדום, ומערכת אריזה מדור שלישי. LVS מתפזרת התקשורת נאספת 24 עד 72 שעות מאוחר יותר. את חלקיקי הנגיף מרוכזים עם פוליאתילן גליקול (PEG), שיטה נוחה וקלה של ריכוז נגיפי, לפני האמידה כייל באמצעות אנטיגן p24 assay immunosorbent אנזים צמוד ערכה (ELISA). כתוצאה מכך, התאים HBE העיקרי מובחן הם transduced במדיה התפשטות (מדיום הגידול אפיתל הסימפונות או BEGM) 8, תוך הצמדת (לאחר trypsinized), על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) גורם של 4, הוספת ברומיד hexadimethrine דוגרים במשך 16 שעות ( בין לילה). התאים מותר אז להבדיל. מאז transgene ויראלי מתבטא לטווח ארוך (באמצעות האמרגן המתאים, ראה דיון), הביטוי יישמר לאורך בידול לתוך האפיתל בדרכי הנשימה pseudostratified או יכול להיגרם (באמצעות האמרגן מושרה) לאחר התמיינות.
<p clתחת = "jove_content"> פרוטוקול זה הוא עניין רחב לחוקרים שרוצים להשתמש בתאי HBE עיקריים במקום שורות תאים, והוא עשוי להיות להתאמה קשה אחרים כדי transduce סוגי תאים.Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מבטיח קרוב יעילות התמר 100%. עם זאת, ישנם צעדים בתהליך שחשובים להשיג מטרה זו. למשל, במהלך תהליך transfection, הנוכחות של משקעים בתמהיל התמרה (ירידה) או בצלחת מחרתיים התמרה (1b הדמוי ד) שהן גם רלוונטיות עבור transfection טוב. היעדרה של משקע או בנו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים הסוכנות שחזור איברים חיים הברית של אוניברסיטת מיאמי למתן הריאות. כמו כן, אנו מודים לד"ר ליסה Künzi לעריכת DNA המשמש הניסויים שמוצג באיור 2B ו 3-D, ד"ר בן Gerovac וליסה נובאק עבור וירוס mCherry המשמש הניסויים איורים 3A ל C. אנו מודים גם גבריאל Gaidosh ממתקן הדמיה, מחלקת עיניים באוניברסיטת מיאמי.
מחקר זה כבר ממומן על ידי תרומות של NIH, קרן CF והמכון למחקר הרפואי הדיילת אל ד"ר מתיאס Salathe.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
References
- Ding, B., Kilpatrick, D. L. Lentiviral vector production, titration, and transduction of primary neurons. Methods Mol Biol. 1018, 119-131 (2013).
- Sinn, P. L., Sauter, S. L., McCray, P. B. Gene therapy progress and prospects: development of improved lentiviral and retroviral vectors–design, biosafety, and production. Gene Ther. 12, 1089-1098 (2005).
- Cribbs, A. P., Kennedy, A., Gregory, B., Brennan, F. M. Simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells. BMC Biotechnol. 13, (2013).
- Delenda, C. Lentiviral vectors: optimization of packaging, transduction and gene expression. J Gene Med. 6 Suppl 1, S125-S138 (2004).
- Gresch, O., Altrogge, L. Transfection of difficult-to-transfect primary mammalian cells. Methods Mol Biol. 801, 65-74 (2012).
- Jordan, E. T., Collins, M., Terefe, J., Ugozzoli, L., Rubio, T. Optimizing electroporation conditions in primary and other difficult-to-transfect cells. J Biomol Tech. 19, 328-334 (2008).
- Castillon, N., et al. Regeneration of a well-differentiated human airway surface epithelium by spheroid and lentivirus vector-transduced airway cells. J Gene Med. 6, 846-856 (2004).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol Med. 107, 183-206 (2005).
- Gonzalez-Mariscal, L., et al. Role of calcium in tight junction formation between epithelial cells. Am J Physiol. 259, C978-C986 (1990).
- Bals, R., et al. Transduction of well-differentiated airway epithelium by recombinant adeno-associated virus is limited by vector entry. J Virol. 73, 6085-6088 (1999).
- Ricks, D. M., Kutner, R., Zhang, X. Y., Welsh, D. A., Reiser, J. Optimized lentiviral transduction of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17, 441-450 (2008).
- Davis, H. E., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 97, 159-172 (2002).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, 341-347 (2013).
- Manzanares, D., et al. Functional apical large conductance, Ca2+-activated, and voltage-dependent K+ channels are required for maintenance of airway surface liquid volume. J Biol Chem. 286, 19830-19839 (2011).
- Schmid, A., et al. Real-time analysis of cAMP-mediated regulation of ciliary motility in single primary human airway epithelial cells. J Cell Sci. 119, 4176-4186 (2006).
- Unwalla, H. J., Ivonnet, P., Dennis, J. S., Conner, G. E., Salathe, M. Transforming growth factor-beta1 and cigarette smoke inhibit the ability of beta2-agonists to enhance epithelial permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 52, 65-74 (2015).
- Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnol. 6, (2006).
- Schneiderman, S., Farber, J. L., Baserga, R. A simple method for decreasing the toxicity of polyethylene glycol in mammalian cell hybridization. Somatic Cell Genet. 5, 263-269 (1979).
- Schmid, A., et al. Soluble adenylyl cyclase is localized to cilia and contributes to ciliary beat frequency regulation via production of cAMP. J Gen Physiol. 130, 99-109 (2007).
- Manzanares, D., et al. Airway Surface Dehydration by Transforming Growth Factor beta (TGF-beta) in Cystic Fibrosis Is Due to Decreased Function of a Voltage-dependent Potassium Channel and Can Be Rescued by the Drug Pirfenidone. J Biol Chem. 290, 25710-25716 (2015).
- Manzanares, D., et al. IFN-gamma-mediated reduction of large-conductance, Ca2+-activated, voltage-dependent K+ (BK) channel activity in airway epithelial cells leads to mucociliary dysfunction. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L453-L462 (2014).
- Chen, X., et al. A soluble adenylyl cyclase form targets to axonemes and rescues beat regulation in soluble adenylyl cyclase knockout mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, 750-760 (2014).
- Ransford, G. A., et al. Pannexin 1 contributes to ATP release in airway epithelia. Am J Respir Cell Mol Biol. 41, 525-534 (2009).
