Assay van Adhesie Under Shear Stress voor de Studie van T-lymfocyten-Adhesie Molecule Interacties
Summary
Deze stroom adhesietest een eenvoudige, high impact model van T-cel-epitheliale cel interacties. Een spuitpomp gebruikt om afschuifspanning te genereren en confocale microscopie neemt beelden voor kwantificering. Het doel van deze studies is om effectief te kwantificeren T-cel adhesie met behulp van stroom omstandigheden.
Abstract
Overall, T-cel adhesie is een kritische component van functie bijdraagt aan de verschillende processen van cellulaire rekrutering op plaatsen van ontsteking en interactie met antigeen presenterende cellen (APC) bij de vorming van immunologische synapsen. Deze twee contexten van T cel adhesie verschil is dat T-cel-interacties APC kan statisch worden beschouwd, terwijl T-cel-interacties bloedvat worden geconfronteerd met de schuifspanning die door circulatie zelf. T-cel-interacties APC worden geclassificeerd als statisch, dat de twee mobiele partners statisch ten opzichte van elkaar. Meestal deze interactie plaatsvindt binnen de lymfeklieren. Als een T-cel interageert met de wand van het bloedvat, de cellen te arresteren en moet de gegenereerde shear stress te weerstaan. 1,2 Deze verschillen onderstrepen de noodzaak om beter te begrijpen statische hechting en hechting onder stroom voorwaarden als twee afzonderlijke wettelijke processen. De regulering van T-cel-adhesie kunnen de meeste bondig worden omschreven als controlling de affiniteitstoestand integrine moleculen tot expressie gebracht op het celoppervlak, en daardoor de interactie van integrinen met het adhesiemolecuul liganden op het oppervlak van de interagerende cellen reguleren. Onze huidige kennis van de regulatie van integrine affiniteit staten komt uit vaak simplistisch in vitro modelsystemen. De bepaling van adhesie middels stroming hier beschreven omstandigheden maakt de visualisatie en kwantificatie van T-cel-epitheliale cel interacties in real time volgen van een stimulus. Een hechting onder stroom test kan worden toegepast op studies van hechting signalering in T-cellen na behandeling met remmende of stimulerende stoffen. Bovendien kan deze test worden uitgebreid buiten T-cel signalering naar elke lijm leukocyten bevolking en eventuele integrine-adhesie molecuul pair.
Introduction
T lymfocyt adhesie medieert een aantal verschillende werkwijzen in een gezond immuunsysteem, 3 cruciale rol spelen in T celtransport en antigeenpresentatie. Of tijdens immune surveillance of een actieve immuunreactie beide brede rollen voor hechting kritisch. 4 Fysiologische signalering gebeurtenissen van T-cel-endotheelcelinteracties verschillen van T-cel-antigeen-presenterende cel (APC) interacties en vereisen daarom verschillende methodes studie om het best begrijpen de signalering cascades betrokken. De firma hechting van een T-cel naar een wand van het bloedvat tijdens lymfocyten extravasatie vereist een snelle en dynamische integrine activering. De nauwe interactie tussen een actieve toestand integrine en adhesiemoleculen aan het endotheel leidt tot hechting bestand tegen de bloedstroom, waardoor T-cellen te kruipen langs het oppervlak, op zoek naar een gebied permissief celpassage. 5 het doorzoeken van een T-cel bi -directionally alonga bloedvatwand is aangewezen op gepolariseerd hechting en is uitdrukkelijk kleefstof vooreinde van de T-cel. 6 Belangrijker, stevige adhesie en transmigratie bestand moeten zijn tegen de afschuifkracht opgewekt door circulerende bloedstroom.
Bij het ontwerpen van experimenten om lymfocyt adhesie studeren, moet aandacht worden besteed aan de specifieke stimulus van belang. Terwijl integrine activering een gemeenschappelijke en essentieel onderdeel van alle vormen van T-cel adhesie, de stromen van activering waarschijnlijk unieke stroomafwaarts van individuele receptoren en co-receptoren zijn. Evenzo, en integrine adhesiemoleculen paren functioneren in gespecialiseerde micro-omgevingen en specifieke subpopulaties. Zo kunnen deze paren heel verschillend geregeld. De hier gepresenteerde model is ideaal voor de studie van signalering cascades leidt aan integrine activering plaatsvindt onder schuifspanning omstandigheden. 7 Deze interacties kunnen niet adequaat worden opgevat in een statische lijm,betreffende systeem door het effect van deze krachten bleek direct bij hebben op T-cel gedrag. 8 Hoewel hier voorgesteld met T-cellen en CHO (Chinese Hamster Ovarium) cellen om humaan ICAM-1 (CHO-ICAM-cellen) tot expressie kan het systeem eenvoudig worden aangepast verschillende leukocyt populaties of adhesiemoleculen te bestuderen.
Deze analyse verschaft een werkwijze om T-cel hechting en integrine activering kwantificeren volgens afschuifspanning, die een model voor de stevige adhesie fase van extravasatie van leukocyten. Door het gebruik van CHO-cellen ICAM de affiniteit van LFA-1 voor zijn ligand in levende cellen in real time kan worden onderzocht in reactie op verschillende stimuli plaats. Deze techniek vereist gemakkelijk te verkrijgen, in de handel verkrijgbare micro-stromingskamers in combinatie met een spuitpomp, veel eenvoudiger de nodige bloedstroom en schuifspanning modelleren apparatuur in vergelijking met andere modellen. 9 Een ander groot voordeel van deze test is dat specifieke signaleringcascades en de resulterende activatie status van afzonderlijke integrinen kan netjes worden bestudeerd door het gebruik van gemanipuleerde CHO-cellen die humane adhesiemoleculen plaats. Bovendien is de combinatie van kwantitatieve gegevens beeldvorming van levende cellen is een belangrijk voordeel van deze methode. Overall, terwijl een aantal assays statische T celadhesie beschreven die mooi model T-cel-interacties APC, deze modellen zijn onvoldoende vastleggen van het dynamische proces van T-cel-epitheliale adhesie. Daarom, bij het kiezen van een adhesietest de stimulus opnieuw dienen te worden beschouwd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om goed te analyseren T celadhesie, de stimulans voor opname in de studie moet worden overwogen bij het kiezen van een in vitro werkwijze. Hoewel er verschillende assays om signalen leidt tot LFA-1 activering en ICAM-1 bindende bestuderen alle methoden zijn niet uitwisselbaar. Een statische hechting assay 10 is het meest geschikt voor T-cel-APC interacties te bestuderen; Als alternatief kan de shear stress methode die hier beschreven is ideaal om T-cel-epitheliale cel interacties te modelleren….
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides – based on numerical calculations. Application Note 11. , (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
