Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה
Summary
assay הידבקות זרימה זו מספק מודל השפעה פשוט, גבוה של אינטראקציות תא אפיתל T. משאבת מזרק משמש להפקת מאמץ הגזירה, וכן במיקרוסקופ confocal לוכדת תמונות כימות. מטרת המחקרים אלה היא לכמת הידבקות תא T ביעילות באמצעות תנאי זרימה.
Abstract
בסך הכל, הידבקות תא T היא מרכיב קריטי של פונקציה, תורם תהליכים השונים של גיוס הסלולר לאתרים של דלקת ואינטראקציה עם תאי מציגי אנטיגן (APC) להיווצרות של סינפסות חיסונית. שני אלה בהקשרים של הידבקות התא T נבדלים כי T אינטראקציות תא-APC יכול להיחשב סטטי, ואילו אינטראקציות כלי תא-דם T מאותגרים על ידי מאמץ הגזירה שנוצר כתוצאה מזרימת עצמה. אינטראקציות T תא-APC מסווגים סטטי ששני השותפים הסלולר ביחס סטטי זה לזה. בדרך כלל, האינטראקציה הזו מתרחשת בתוך בלוטות הלימפה. כתא T אינטראקציה עם דפנות כלי דם, תאי המעצר חייב להתנגד מאמץ גזירה שנוצר. 1,2 הבדלים אלו מדגישים את הצורך להבין טוב יותר את הידבקות הידבקות סטטית בתנאי זרימה כשני תהליכים רגולטוריים ברורים. הסדרת הידבקות תא T ניתן לתאר באופן תמציתי ביותר כמו conחכות מדינת הזיקה של integrin מולקולות לידי ביטוי על פני התא, ובכך המסדיר את יחסי הגומלין של integrins עם ליגנדים מולקולת הידבקות ביטוי על פני השטח של תא האינטראקציה. ההבנה הנוכחית שלנו של הרגולציה של מדינות זיקת integrin מגיעה לעתים קרובות פשטני במערכות מודל במבחנה. את assay של הידבקות באמצעות תנאי הזרימה המתואר כאן מאפשר הדמיה וכימות מדויק של אינטראקציות תא אפיתל T בזמן אמת בעקבות גירוי. הידבקות תחת assay זרימה יכולה להיות מיושמת על מחקרים של הידבקות איתות בתוך תאי T לאחר טיפול עם חומרים מעכבים או גירוי. בנוסף, assay הזה ניתן להרחיב מעבר T תא איתות לכל אוכלוסייה לויקוציטים הדבק וכל זוג מולקולת integrin-הידבקות.
Introduction
T הידבקות הלימפוציטים מתווכת מספר תהליכים שונים במערכת חיסונית בריאה, 3 ממלאים תפקידים מהותיים בסחר תא T והצגת אנטיגן. בין אם במהלך מעקב חיסוני או תגובה חיסונית פעילה שני תפקידים רחבים אלו הידבקות הם קריטיים. 4 אירועי האיתות הפיסיולוגיים של אינטראקציות תא האנדותל T נבדלים אנטיגן לתא T הצגת תא אינטראקציות (APC), ולכן דורשים שיטות שונות של מחקר כדי להבין בצורה הטובה ביותר מפלי איתות מעורבים. הידבקות המשרד של תא T לקיר כלי דם במהלך extravasation לימפוציטים דורשת הפעלת integrin מהירה ודינמית. האינטראקציה ההדוקה בין מולקולות integrin הידבקות מצב פעילות לאורך האנדותל מובילה הידבקות עמידה לזרימת דם, מה שמאפשר לתאי T לזחול על פני השטח בחיפוש אחרים שטח מתירנית למעבר תא. 5 הזחילה של המדינה דו תא T -directionally אלוןדפנות כלי דם ga הן סומכות על הידבקות מקוטבת, עם כחזית דבק נבדל של תאי T. 6 והחשוב מכל, הדבקה איתן גלגול דורשים התנגדות לכוח הגזירה שנוצר על ידי מחזורי את זרימת דם.
בעת תכנון ניסויים כדי ללמוד הידבקות לימפוציטים, יש לשים לב לגירוי מסוים של עניין. בעוד integrin הפעלה הוא מרכיב נפוץ וביקורתי של כל הצורות של הידבקות תא T, במפלי ההפעלה צפויים להיות ייחודי במורד זרם של קולטנים פרט-קולטנים שיתוף. כמו כן, integrin וזוגות מולקולת ההידבקות לתפקד microenvironments מיוחד על תת-אוכלוסיות ספציפיות. בדרך זו, זוגות אלה עשויים להיות מוסדרים בצורה שונה לגמרי. המודל המוצג כאן הוא אידיאלי לחקר איתות מפלי מוביל integrin הפעלה מתרחשת בתנאי מאמץ גזירה. 7 אינטראקציות אלה לא ניתן להבין כראוי בתוך מודבק סטטיבמערכת עקב השפעת הכוחות הללו הוכחו יש ישירות על התנהגות התא T. 8 למרות שהן מוצגות כאן עם תאי T ו CHO תאים (שחלה של אוגר סיני) שהונדסו (תאים CHO-ICAM) האדם ICAM-1 במערכת יכול בקלות להיות שונה כדי ללמוד אוכלוסיות לויקוציטים שונים או מולקולות דבקות.
assay זה מספק שיטה לכמת דביקות תא T והפעלה integrin באמצעות מאמץ הגזירה, מתן מודל לשלב הידבקות המשרד של extravasation לויקוציטים. באמצעות שימוש בתאי CHO-ICAM הזיקה של LFA-1 עבור ליגנד שלה בתאים חיים ניתן לבדוק בזמן אמת בתגובה לגירויים שונים של עניין. טכניקה זו דורשת להשיג בקלות, זמינים מסחרי תאי מייקרו-זרימה בשילוב עם משאבת מזרק, מאוד לפשט את הציוד הדרוש מודל זרימת דם ואת לחץ גזירה לעומת דגמים אחרים. 9 עוד יתרון חשוב של assay זה הוא כי איתות ספציפיתמפלי מדינת ההפעלה וכתוצאה מכך של integrins הבודד ניתן ללמוד בצורה נקיה באמצעות השימוש בתאי CHO מהונדסים לבטא מולקולות דבקות אדם של עניין. בנוסף, שילוב של נתונים כמותיים עם הדמית תא חי הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. בסך הכל, בעוד מספר מבחנים של הידבקות תא סטטי T תוארו כי יפה מודל T אינטראקציות תא-APC, מודלים אלה אינם מספיקים לכידת התהליך הדינמי של הידבקות תא-אפיתל T. מסיבה זו, בעת בחירת assay הידבקות הגירוי הנדון יש לקחת בחשבון.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי כראוי לנתח הידבקות תא T, את החומר מהגוף להיכלל במחקר יש לקחת בחשבון בעת בחירת שיטה במבחנה. אמנם יש מספר מבחנים ללמוד אותות שמובילים הפעלת LFA-1 ו- ICAM-1 מחייב כל השיטות אינן ניתנות להחלפה. Assay הידבקות סטטית 10 הוא המתאים ביותר כדי לחקור אינטראקציות T תא-APC; לחלו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.
Materials
| T cell samples (cell line or primary) | ATCC | TIB-152 | Peripheral human T cells |
| CHO-ICAM-1 cells | ATCC | CRL-2093 | |
| µ-Slide VI 0.4 ibiTreat | ibidi | 80606 | |
| 500 ml glass bottle | Fisher | FB800500 | |
| 250 ml glass bottle | Fisher | FB800250 | |
| Silicone tubing 0.8 mm | ibidi | 10841 | |
| Confocal microscope with incubator chamber | Ziess | 700 | Any wide field fluorescent microscope |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| CFSE | eBioscience | 65-0850 | |
| SDF-1α | R&D | 350-NS-010/CF | |
| RPMI | Lonza | 12-702F/12 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| D-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| PMA | Sigma Aldrich | 16561-29-8 | |
| Volocity software | Perkin Elmer | Version 6.2.1 | |
| ImageJ software | NIH | Version 1.48V | |
| Tissue-culture treated culture dishes | Falcon | 353003 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher | BP295950 |
References
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Su, W., et al. Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking. Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes. J Vis Exp. (88), (2014).
- Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides – based on numerical calculations. Application Note 11. , (2014).
- van Gijsel-Bonnello, M., et al. Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration. J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).
- Tozeren, A., et al. Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1. Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).
- Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability. Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).
- Rot, A. In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells. J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).
- Yang, L., et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow. Blood. 106 (2), 584-592 (2005).
- Long, E. O. ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion. J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).
