Analyse af Vedhæftning Under Shear Stress for Studiet af T-lymfocyt-adhæsionsmolekyle Interactions

Summary

Denne strøm adhæsion assay tilvejebringer en enkel, høj slagstyrke model af T-celle-epitel celle-interaktioner. En sprøjte pumpe anvendes til at generere forskydningsspænding, og konfokal mikroskopi tager billeder til kvantificering. Målet med disse undersøgelser er at effektivt kvantificere T-celle adhæsion ved hjælp strømningsforhold.

Abstract

Samlet, T-celle-adhæsion er et afgørende element i funktion, bidrager til de forskellige processer af cellulær rekruttering til steder med inflammation og interaktion med antigenpræsenterende celler (APC) i dannelsen af ​​immunologiske synapser. Disse to sammenhænge T-celle-adhæsion forskellige med, at T-celle-APC-interaktioner kan betragtes statisk, mens celle T-blodkarrenes interaktioner udfordres af forskydningsspændingen genereret af selve cirkulation. T-celle-APC-interaktioner er klassificeret som statisk ved, at de to cellulære partnere er statisk i forhold til hinanden. Sædvanligvis er denne interaktion sker inden lymfeknuderne. Som T-celle interagerer med blodet karvæggen, cellerne anholde og skal modstå den genererede forskydningsspænding. ^1,2 Disse forskelle understreger behovet for bedre at forstå statisk klæbeevne og vedhæftning under strømningsforhold som to distinkte regulatoriske processer. Reguleringen af ​​T-celle adhæsion kan mest rammende beskrives som controlling affinitet tilstand af integrin-molekyler udtrykt på celleoverfladen og derved regulere interaktionen af ​​integriner med adhæsionsmolekylet ligander udtrykt på overfladen af ​​det interagerende celle. Vores nuværende forståelse af reguleringen af integrin affinitet stater kommer fra ofte forsimplede in vitro modelsystemer. Assayet af adhæsion under anvendelse af strømningsforhold beskrevet her tillader visualisering og nøjagtig kvantificering af T-celle-epitel celle-interaktioner i realtid efter en stimulus. En adhæsion under flow assay kan anvendes til studier af adhæsion signalering inden T-celler efter behandling med inhiberende eller stimulerende stoffer. Derudover kan dette assay udvides ud over T-celle-signalering til enhver klæbende leukocytpopulationen og enhver integrin-adhæsionsmolekyle par.

Introduction

T-lymfocyt vedhæftning medierer en række forskellige processer i et sundt immunsystem, ³ spiller kritiske roller i T-celle menneskehandel og antigen præsentation. Hvad enten under immunovervågning eller et aktivt immunrespons disse to brede roller for adhæsion er kritiske. ⁴ De fysiologiske signaleringsbegivenheder af T-celle-endotelcelle-interaktioner er forskellige fra T-celle-antigen-præsenterende celle (APC) interaktioner, og derfor kræver helt forskellige måder undersøgelse til bedst forstår signaleringskaskader involveret. Den faste adhæsion af en T celle til et blodkar væg under lymfocyt ekstravasation kræver hurtig og dynamisk aktivering integrin. Den stramme interaktion mellem en aktiv tilstand integrin og adhæsionsmolekyler langs endotel fører til adhæsion resistent over for strømmen af blod, hvilket tillader T-celler at kravle langs overfladen i søgning af et område permissiv til celle passage. ⁵ gennemgang af en T celle bi -directionally alonga blodkarvæggen er afhængige af polariseret adhæsion, med et særskilt klæbende forende af T-cellen. ⁶ Vigtigst faste adhæsion og transmigration kræver resistens over for forskydningskraften frembragt ved cirkulerende blod flow.

Når du designer eksperimenter for at studere lymfocyt vedhæftning, bør man være opmærksom på den specifikke stimulus af interesse. Mens integrinaktivering er en almindelig og kritisk komponent af alle former for T-celle-adhæsion, de kaskader af aktivering vil sandsynligvis være unik nedstrøms for individuelle receptorer og co-receptorer. Ligeledes integrin og vedhæftning molekyle par fungerer i specialiserede mikromiljøer og om særlige subpopulationer. På denne måde kan disse par reguleres ganske forskelligt. Modellen præsenteret her er ideel for studiet af signalering kaskader fører til integrinaktivering finder sted under forskydning stressbetingelser. ⁷ Disse interaktioner kan ikke i tilstrækkelig forstås i en statisk adhesion system på grund af virkningen af disse kræfter er blevet vist at have direkte på T-celle adfærd. ⁸ Selvom præsenteres her med T-celler og CHO (kinesisk hamsterovarie) celler konstrueret til at udtrykke human ICAM-1 (CHO-ICAM-celler) dåsen systemet let modificeres til at studere forskellige leukocytpopulationer eller adhæsionsmolekyler.

Dette assay tilvejebringer en fremgangsmåde til at kvantificere T-celle klæbeevne og integrin-aktivering ved hjælp af shear stress, hvilket giver en model for faste adhæsion fase af leukocyt-ekstravasation. Gennem brug af CHO-ICAM-celler kan undersøges affiniteten af ​​LFA-1 til liganden med levende celler i realtid som respons på forskellige stimuli af interesse. Denne teknik kræver let opnås kommercielt tilgængelige mikro-flow kamre i kombination med en sprøjtepumpe, i høj grad forenkler det nødvendige udstyr til at modellere blodgennemstrømning og forskydningsspænding i forhold til andre modeller. ⁹ En anden stor fordel ved dette assay er, at signaleringkaskader og den resulterende aktiveringstilstanden af ​​individuelle integriner kan rent undersøgt ved anvendelse af gensplejsede CHO-celler udtrykker humane adhæsionsmolekyler af interesse. Derudover kan kombinationen af ​​kvantitative data med levende celler er en væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde. Samlet, medens en række assays af statisk T-celle adhæsion er blevet beskrevet, at pænt Model T-celle-APC interaktioner, disse modeller er utilstrækkelig til at fange den dynamiske proces med T-celle-epitel vedhæftning. Af denne grund, når de vælger en adhæsion assay må betragtes som den stimulus pågældende.

Protocol

1. udpladning af CHO-ICAM Cells Bemærk: Målet med dette trin er at plettere CHO-ICAM-celler i strømningskamre for vækst natten over med det mål at frembringe et sammenflydende monolag. Oprethold CHO-ICAM-celler i cellekultur behandlet 10 cm dyrkningsskåle i 10 ml RPMI-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (CHO-ICAM komplet dyrkningsmedium) ved 37 ° C med 5% CO2. At indsamle celler, tilsættes 1 ml 0,5% trypsin-EDTA og inkuberes …

Representative Results

Repræsentative resultater er vist fra strømmen adhæsion assay ved anvendelse Jurkat og primære humane CD3 + T-celler, som indikeret, stimuleret med SDF-1α. De negative kontroller i alle viste eksperimenter er stimulerede celler. En tærskel basal procent vedhæftning af stimulerede celler er mellem 5 – 10%; basen adhæsion navnlig over dette interval angiver en problematisk eksperiment og foreslår starten population af T-celler blev ikke-specifikt præaktiveret under for…

Discussion

For at kunne analysere T-celle adhæsion, at det stimulerende middel være inkluderet i undersøgelsen skal overvejes ved valg af en in vitro-fremgangsmåde. Mens der er flere analyser for at studere signaler, der fører til LFA-1 aktivering og ICAM-1 binding alle metoder ikke er indbyrdes udskiftelige. En statisk vedhæftning assay ¹⁰ er bedst egnet til at studere T-celle-APC-interaktioner; alternativt forskydningsspændingen metode beskrevet her er ideel til model T-celle-epitel celle-interaktioner…

Materials

T cell samples (cell line or primary)	ATCC	TIB-152	Peripheral human T cells
CHO-ICAM-1 cells	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500 ml glass bottle	Fisher	FB800500
250 ml glass bottle	Fisher	FB800250
Silicone tubing 0.8 mm	ibidi	10841
Confocal microscope with incubator chamber	Ziess	700	Any wide field fluorescent microscope
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE-300
60 ml syringe	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R&D	350-NS-010/CF
RPMI	Lonza	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
Microcentrifuge	Eppendorf	5424
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity software	Perkin Elmer	Version 6.2.1
ImageJ software	NIH	Version 1.48V
Tissue-culture treated culture dishes	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red	Gibco	25200114
Heat Inactivated FBS	Denville	FB5001-H
Penicillin/Streptomycin	Fisher	BP295950