Summary
Se describe un método simple para establecer la placenta humana primaria (vellosidades) y cultivos de órganos de la decidua. cultivos de órganos de las vellosidades y decidua son herramientas muy valiosas para el estudio de la patogénesis en la interfase materno-fetal humano. La infección con la bacteria intracelular Listeria monocytogenes facultativos se demuestra.
Abstract
La placenta se muestra un alto grado de variabilidad anatómica entre especies. Para entender mejor la biología y la fisiopatología de la placenta humana, es imperativo para diseñar experimentos utilizando células y tejidos humanos. Una ventaja de cultivo de órganos es el mantenimiento de tres dimensiones (3D) organización estructural y de la matriz extracelular. El objetivo del método descrito aquí es el establecimiento exitoso de ex vivo cultivos de órganos tejidos humanos gestacional y su mantenimiento sana cultura de 72-96 h. El protocolo detalla el procesamiento inmediato de la investigación con autorización, de la placenta y la decidua especímenes frescos de la sala de operaciones. Estos son abundantes especímenes que de otro modo serían descartados. Las instrucciones detalladas sobre la recogida estéril de estas muestras, incluyendo los detalles morfológicos sobre cómo seleccionar los tejidos adecuados para establecer cultivos de órganos en 3D, se proporciona. Tejidos vellosos y deciduales placentarios se microdissected en 2-3 mm de 3 piezasy se colocan por separado en filtros transwell matriz forrado y se cultivaron durante varios días. Velloso y cultivos de órganos deciduales son muy adecuadas para el estudio de la interacción huésped-patógeno humano. En comparación con otros organismos modelo, estas culturas humanas son particularmente ventajosas para examinar el mecanismo de la infección por patógenos que demuestran patrones variables de especificidad de huésped. A modo de ejemplo, se demuestra la infección de cultivos de órganos de la placenta y la decidua con el patógeno bacteriano Listeria monocytogenes intracelulares facultativos, clínicamente relevantes.
Introduction
La infección y la inflamación en la interfase materno-fetal representa una fuente importante de morbilidad y mortalidad en las mujeres y los niños. La comprensión de cómo los patógenos infectan a estos tejidos es fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias para prevenir y tratar enfermedades como el trabajo de parto prematuro y muerte fetal. Sin embargo, los altos variabilidad entre especies de la interfase materno-fetal complica la investigación experimental. Además, la mayoría de patógenos microbianos muestran especificidad de huésped, por tanto, muchos modelos animales no puede recapitular completamente las enfermedades infecciosas humanas. Ciertos organismos (Haemophilus influenzae, Salmonella typhi, Vibrio cholerae, y numerosos otros) son estrictamente patógeno en los seres humanos, mientras que otros, tales como Listeria monocytogenes, muestran un nivel más intermedio de especificidad de huésped 1. Especificidad de huésped se ha documentado en muchos aspectos de la patogénesis, incluyendo la colonización 2, 3 difusión, la evasión inmune 4 5. Por lo tanto, es de suma importancia para seleccionar sistemas modelo de acogida óptimos.
Compuesto de células fetales en sangre materna y, la placenta es un órgano que se desarrolla rápidamente durante el curso de la gestación 6. En términos más simples, la placenta humana está construida con estructuras en forma de árbol fetales "vellosas" bañadas en la sangre materna. Gas y el intercambio de nutrientes se produce a través de capas de células fetales especializadas llamadas trofoblastos que recubren la superficie de los árboles vellosos. El revestimiento de la mucosa uterina materna, llamado endometrio en la mujer no embarazada, transforma estructuralmente y funcionalmente en la decidua para dar cabida a la unidad fetoplacentaria. árboles vellosidades están anclados en el útero por trofoblastos extravillous (EVT) que migran desde el anclaje de columnas de células en la decidua. La interfase materno-fetal, por lo tanto, consiste en decidua y la placenta.
La técnica de cultivo de órganos describe aquíha sido utilizado para examinar dónde y cómo los patógenos humanos clínicamente relevantes, incluyendo L. monocytogenes s y Toxoplasma gondii, atraviesan la barrera placentaria 2,7. Estos cultivos de órganos ex vivo se replican en la arquitectura del tejido vivo, y son sin duda los sistemas modelo fisiológicamente altamente relevantes para la placentación humano. Las técnicas de cultivo adicionales incluyen explantes de órganos enteros, rebanadas de órganos y tejidos o de células madre organoides celulares embebidos en matriz en 3D. Para más detalles sobre estas opciones, por favor referirse a una reciente revisión exhaustiva 8. Tenga en cuenta que este protocolo es para la cultura separada de la decidua y vellosidades placentarias. Para el estudio de la interacción entre células de la placenta y células deciduales, una técnica de co-cultivo puede ser preferido. Remitimos al lector interesado a la técnica de co-cultivo de las vellosidades-decidual anteriormente descrito, utilizado por los investigadores que estudian la remodelación vascular mediada decidual trofoblasto 9-11.
Protocol
Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California en San Francisco (CHR # 11-05.530). Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y su posterior análisis. El tejido se recogió en forma de ejemplares identificados de-.
NOTA: El investigador debe obtener la aprobación de su junta de revisión institucional sujetos humanos. La exclusión de las muestras de acuerdo a la historia de la placenta o anomalías de gestación varía de acuerdo con las necesidades de cualquier estudio específico.
NOTA: Las condiciones apropiadas de seguridad (nivel de bioseguridad 2) deben ser utilizados para todos los pasos de este protocolo 12.
1. Preparación, antes del día de Colección
- coladores autoclave / fórceps para la recolección y tijeras / fórceps para microdisección.
- Preparar un volumen adecuado (500 ml por muestra) de tampón de lavado (refer a la Tabla 1 para la receta).
- Prepare un volumen adecuado (100 ml por muestra) de 0,22 M Colección medios esterilizada por filtración (consulte la Tabla 1 para la receta).
- Alícuota de la matriz extracelular (ECM, consulte la Tabla de Reactivos para más detalles) para el almacenamiento a largo plazo.
- ECM tienda en forma sólida a -20 ° C. Para un mejor rendimiento, evitar la congelación y descongelación repetida. Descongelar la botella a una solución viscosa a 4 ° C, y preparar 300 ml de alícuotas en el cuarto frío con puntas de pipeta refrigerados. almacenar alícuotas a -20 ° C.
2. Recolección de tejido fresco
PRECAUCIÓN: Cuando se trabaja con el tejido humano fresco, los investigadores deben seguir las precauciones universales (OSHA) para prevenir la transmisión de patógenos en la sangre, y deben haber recibido una formación institucional adecuado. equipo de protección personal, incluyendo guantes, protección ocular, y batas de laboratorio son necesarios.
- Transportecoladores tratadas en autoclave (una por muestra), fórceps esterilizados en autoclave, tampón de lavado (bombona), los medios de comunicación de la colección (25 ml por muestra en un tubo cónico de 50 ml), botella de spray, lejía al 10%, el 70% de etanol, bandeja de recogida de tejidos, Sharpie y cubo de hielo / refrigerador al hospital / clínica.
NOTA: Las muestras se reciben en un espacio de investigación-señalado situado en una habitación cerca de la sala de operaciones. No se requiere una campana de cultivo de tejido estéril, pero la recolección debe producirse con rapidez y el investigador debe desinfectar adecuadamente las superficies, como se describe a continuación. - Lugar bombona de tampón de lavado al lado del fregadero, y el spray grifo con lejía al 10% y el 70% de etanol. Lugar de vidrio bandeja de recogida de tejido en la fuente de luz (tecla de luz o caja de luz), y desinfectar con lejía al 10% y el 70% de etanol. Deje secar al aire.
- Tener las muestras conductoras clínico de la sala de operaciones a la sala de preparación de la muestra. En el lavabo, vierta la muestra encima del filtro de mano estéril, enjuague el tejido varias veces en Wastampón h, y la transferencia del espécimen entero en tampón de bandeja de vidrio desinfectados lo alto de la fuente de luz.
NOTA: Evaluación de tejido por el clínico es de prioridad más alta, por lo que los siguientes pasos sólo se realizan después de que el médico ha indicado verbalmente que él / ella ha terminado la evaluación. - El uso de fórceps estériles para seleccionar las vellosidades de la placenta y la decidua (Figuras 2A y 3A) para la recogida y traslado al separar 50 ml tubos cónicos. Etiquetar los tubos con la edad gestacional.
NOTA: Preferencia de edades gestacionales son menos de 9 semanas y menos de 16 semanas de la placenta y la decidua, respectivamente. En la institución, sólo una fracción de cada muestra se procuró para fines de investigación, como el tejido adecuada debe mantenerse para el diagnóstico patológico clínico. - Almacenar y transporte de muestras en hielo al laboratorio de investigación.
- Para recoger más de un espécimen, desinfectar la bandeja de vidrio como se ha descrito anteriormente con lejía al 10% y etanol al 70% entre el Collección de cada muestra.
3. Preparación de placas de cultivo de órganos
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse utilizando una técnica estéril en una campana de cultivo de tejidos. Es ideal para el microscopio de disección que se encuentra en un campo estéril. Sin embargo, esto no es absolutamente necesario, siempre que micro-disección se realiza con rapidez, y los instrumentos se sumergen con frecuencia en 70% de etanol.
- deshielo vial ECM (s) en hielo. Diluir el ECM 1: 1 con los medios de comunicación Collection fríos como el hielo, mezclar con la pipeta. Pipeta lentamente para evitar la introducción de burbujas. Cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos requiere 100 l de esta suspensión y se adaptará a 3-4 cultivos de órganos.
- insertos transwell Place (tamaño de poro 0,4 M) en cada pocillo de placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
- Escudo cada Transwell inserto con una capa delgada (100 l) de la suspensión ECM / media.
- Colocar la placa en el hielo e inmediatamente proceder a establishment de cultivos de órganos. Por otra parte, preparar la placa antes de la recogida de tejidos, en cuyo caso se envuelve en el párrafo de película y se almacena a 4 ° C para su uso posterior. Almacenados por más de 6 horas no se recomienda como el ECM se secará.
4. Establecimiento de cultivos de órganos
NOTA: Este paso se describe cómo colocar cultivos de órganos deciduales y cultivos de órganos de las vellosidades en los cultivos polarizados separadas. Los tejidos no están en contacto. Los investigadores interesados en una técnica de co-cultura en la decidua y vellosidades están en contacto directo entre sí, pueden hacer referencia a la literatura anterior 9,10.
- Enjuague las muestras dos veces en medio de recolección, y se centrifuga a 1.000 xg entre cada enjuague. Transferencia de tejido a una placa de Petri estéril y lugar en el escenario de un microscopio de disección. Mantenga placa de 6 pocillos en hielo adyacente al microscopio.
- tejido de micro-disección con tijeras estériles saltador de disección y pinzas, para establecer de 2-3 mm de cultivo de órganos de las vellosidadess (Figura 2A).
NOTA: cultivos de órganos vellosos son pequeñas "árboles", bien vascularizados con 2 o 3 ramas, y con prominentes columnas de células del trofoblasto extravelloso (EVT) 11. Es importante que se utilice sólo el tejido de las vellosidades de la semana <9 ejemplares del primer trimestre, como la invasión de trofoblastos extravillous en ECM es más pronunciado en estos jóvenes mayores de 13 años. - Seleccionar vellosidades bien vascularizado con prominentes columnas de células EVT. Columnas de células EVT se visualizan como bulbosa, "fuzzy", extremos "suaves" (se refieren a puntas de flecha en la figura 2A).
- El uso de fórceps estériles para transferir 3 o 4 árboles de las vellosidades en cada transwell. Ajuste ramas para árbol se coloca plana encima de ECM y las ramas agrupadas separadas.
- Micro-diseccionar el tejido decidual con las tijeras y pinzas estériles saltador de disección, para establecer 3 mm 3 cultivos de órganos deciduales (Figura 3A).
NOTA: Las muestras contienen dos distinct tipos de tejidos deciduales, decidua parietal y decidua capsular (izquierda y derecha fragmentos de tejido, respectivamente, Figura 3A). - Recorte con tijeras para crear 3 mm 3 piezas de decidua parietal. decidua capsular no se utiliza para estos cultivos. El uso de fórceps para molestar a la basura cualquier coagulada sangre materna.
- El uso de fórceps estériles para transferir 3-4 piezas de decidua en cada transwell.
- Añadir 1 ml de medio Colección de fondo del pozo. Incubar la placa durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2
- Para los experimentos en los que es importante para imitar primer trimestre de tensión normal de oxígeno de la placenta, mantener cultivos de órganos de las vellosidades en la hipoxia relativa (3% O 2).
NOTA: Las opciones de laboratorio incluyen pequeñas cámaras de hipoxia incubadora que caben dentro de las incubadoras existentes, o una incubadora de gas-tri que introduce externa de gas N2 para disminuir la concentración de oxígeno. - Añadir 1 ml de medio de las vellosidades o decidual (TabLe 1) al principio de la transwell después de 12-16 horas de cultivo.
NOTA: La ausencia de medios de comunicación durante la primera durante la noche en un cultivo permite que las columnas de células trofoblasto extravillous para invadir (cultivo velloso), y para el tejido (tanto de las vellosidades y decidual) para convertirse en forma segura incrustado en ECM. En nuestra experiencia, cultivos de órganos deciduales permanecen viables durante 72 hr y órganos de las vellosidades culturas durante 96 horas. Recomendamos criterios de valoración experimentales que caen dentro de este plazo. Véase la Tabla 1 para la composición del medio de las vellosidades y decidua. Medio velloso tiene un alto porcentaje de FBS, mientras que el medio Decidual se complementa con las hormonas del embarazo (progesterona, 17b-estradiol) que mantienen el estado decidualized (Tabla 1).
5. Preparación de L. monocytogenes culturas
NOTA: Para el protocolo detallado en el almacenamiento a largo plazo de L. monocytogenes, y la cultura y el crecimiento de this organismo en infusión de cerebro y corazón caldo y agar (BHI), por favor refiérase a Wang et al. 14
- Elija una sola L. monocytogenes colonia de la placa de agar BHI con rayas e inocular 3 ml de caldo BHI.
- Incubar la L. monocytogenes cultivo durante la noche (16 hr), en una posición inclinada, a 30 ° C.
NOTA:. Estas condiciones de cultivo permiten el crecimiento bacteriano para alcanzar la fase estacionaria L. monocytogenes es flagelado a 30 ° C, lo que aumenta la invasión de células de acogida 15.
6. La infección de los cultivos de órganos con L. monocytogenes
- PBS caliente y velloso o medio decidual (Tabla 1) a 37 ° C.
- Use pinzas estériles para eliminar cualquier pieza de cultivo de órganos que no invaden en el ECM, y por lo tanto están flotando en el pozo.
- Con cuidado aspirar los medios de comunicación desde la parte inferior de la transwell. Enjuague los cultivos polarizados superior e inferior dos veces con la pipeta suavemente 1 ml de guerraM de PBS en los pocillos, y cuidadosamente aspirando en el medio. pipeta suavemente 1 ml de las vellosidades o Decidual medio libre de antibiótico para transwell superior e inferior. Tenga cuidado de no perturbar el cultivo de órganos.
- Deje que el tejido se incuba en un medio libre de antibióticos durante al menos una hora para asegurar que los antibióticos se han eliminado.
NOTA: En fase estacionaria la densidad de la L. cultura monocytogenes es de aproximadamente 1 x 10 9 unidades formadoras de colonias (UFC) por ml. El número de bacterias que se utilizan para infectar cultivos de órganos debe ser determinado empíricamente para satisfacer las necesidades experimentales. - Para el tipo salvaje de L. monocytogenes infección experimentos de rutina muestran invasión robusto con una dilución 1:50 de la noche a la mañana los (4 x 10 7 L. monocytogenes en 1 ml de medio por pocillo). Resuspender el número apropiado de las bacterias en medio de las vellosidades o Decidual libre de antibióticos.
- Aspirar los medios de comunicación desde la parte superior de los cultivos polarizados. agregar suavemente 1 ml de inóculo. Incubar las placas a 37° C en 5% de CO 2 para permitir la invasión bacteriana.
- Eliminar las bacterias extracelulares mediante la aspiración de los medios de cultivos polarizados superior e inferior. Enjuague los pocillos dos veces con PBS caliente. Añadir 1 ml de velloso o medios deciduales suplementado con 50 mg ml -1 gentamicina. Incubar las placas a 37 ° C en 5% de CO 2.
NOTA: L. monocytogenes es una bacteria intracelular facultativa que puede crecer en el medio extracelular, crecer dentro de las células, y propagarse de célula a célula sin acceder al espacio extracelular. Gentamicina tiene un efecto bactericida sobre extracelular L. monocytogenes y por lo tanto permite la medición de intracelular L. monocytogenes y se extendió a través del cultivo de órganos 16.
NOTA: Se puede reproducir L. monocytogenes infección de cultivos de órganos de las vellosidades y decidua se produce con tiempos de incubación de 5 horas. El tiempo de incubación antes de la adición de gentamicina puede ser modifica en función de las necesidades experimentales y el ability del organismo para invadir el tejido. Para comprender mejor los sitios anatómicos más vulnerables a la infección, los tiempos de incubación más cortos se pueden usar 2. - Mantener las placas a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la duración del experimento. Cambio de medio entero en cada pocillo diaria.
NOTA: En nuestra experiencia, L. monocytogenes cultivos de órganos deciduales infectados permanecen viables durante 48 hr culturas y órganos de las vellosidades durante 72 horas.
7. Cosecha de Órganos Los cultivos para Histopatología
- Se prepara una solución fresca de 4% de paraformaldehído por dilución de 10 ml de una 16% de la ampolla en 30 ml de PBS. Tienda paraformaldehído al 4% a 4 ° C, protegido de la luz, y el uso dentro de una semana. Llevar a temperatura ambiente antes de su uso.
- Aspirar los medios de transwell superior e inferior. Enjuague suavemente los pocillos dos veces con PBS a temperatura ambiente. añadir 1 ml suavemente 4% de paraformaldehído al principio de la transwell para cubrir completamente el cultivo de órganos.
- Incubaren 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente durante 20 min. Evitar los tiempos de incubación más largos ya que esto podría conducir a un exceso de la fijación del tejido.
- paraformaldehído Aspirar y pozos de enjuague dos veces con PBS a temperatura ambiente. Integrar los cultivos de órganos fijos en medio OCT, congelar, y la sección en un criostato ( "fixed congelado"). En general, el tejido congelado fija es más fácil de la sección de tejido congelado sin fijación previa.
NOTA: Para el protocolo completo el oct inclusión y corte congelado, por favor, accede a las secciones pertinentes de los protocolos publicados 17,18. Dependiendo de las necesidades experimentales y equipo de laboratorio disponibles y almacenamiento, en lugar de tejido puede ser incluido en parafina y se seccionaron en un micrótomo 19. - Además de preparar diapositivas de tejidos para la rutina Hematoxilina y Eosina, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica 18,20,21.
Representative Results
La Figura 1 (modificado de Zeldovich y Bakardjiev 22) Diagramas de la placenta y la anatomía relevante del útero. La figura 2 muestra representativa bruto e imágenes histológicas de las vellosidades placentarias, mientras que la figura 3 muestra de tejido decidual.
Este protocolo describe por primera vez la colección de la placenta fresco y tejido decidual en el hospital o clínica. La muestra recogida es una mezcla de la placenta fetal (vellosidades) y los componentes uterinas maternas (decidua). Después de aclarar con tampón que contiene antibióticos de amplio espectro y antifúngicos, toda la muestra se inspeccionó visualmente usando una caja de luz. Villi y decidua se colocan en tubos separados y transportados en hielo al laboratorio. En el laboratorio, un microscopio de disección se utiliza para apreciar las características morfológicas finas de tejido sano. fotografías representativas delas vellosidades (Figura 2A) y tejidos deciduales (Figura 3A) que fueron adquiridos con un microscopio de disección con dos fuentes de luz de cuello de cisne externos se muestra como referencia.
cultivos de órganos de las vellosidades se generan a partir de muestras primer trimestre. Culturas consisten en pequeños árboles de las vellosidades terminales con 2-6 ramas. Es importante para diseccionar ramas vellosos que terminan en columnas trofoblásticas extravillous y son bien vascularizada. Estas características se ven como extremos de derivación (puntas de flecha) "esponjoso" o "fuzzy", y el color de rosa a rojo débil lineal que corre por las ramas del árbol a la izquierda en la figura 2A. Por el contrario, vasculatura y trofoblastos extravillous no se visualizan fácilmente para el árbol de la derecha de esta imagen, lo que sería óptimo para el cultivo. Durante el primer día de la cultura, los trofoblastos extravillous migran a la ECM, tHus anclaje de los árboles vellosos en la matriz en la transwell.
cultivos de órganos deciduales se generan a partir de muestras primera y principios del segundo trimestre. Todo el revestimiento del útero se transforma en decidua muy poco después de la implantación. Más específicamente, decidua basal define la mucosa uterina directamente subyacente del sitio placenta / implantación, decidua capsular define mucosa que recubre el feto, y decidua parietal se refiere al resto de las paredes del útero. La visualización bajo un microscopio de disección muestra que el espécimen gestacional temprana consiste en gran parte de la decidua parietal y decidua capsular (izquierda y derecha fragmentos de tejido, respectivamente, en la figura 3A). La decidua capsular se distingue fácilmente por su naturaleza fina, membranosa. Para cultivos de órganos, decidua parietal se recorta a 3 mm 3 fragmentos con unas tijeras de disección y micro-adhealquiler sangre coagulada se retira con una pinza.
Después de la incubación durante la noche, los tejidos están infectados con L. monocytogenes. El protocolo de infección descrito anteriormente se basa en el ensayo de protección de gentamicina utilizado para estudiar el crecimiento intracelular y la propagación de las bacterias intracelulares facultativas 16. Cultivos de órganos en medio libre de antibiótico se incuban con L. monocytogenes durante 5 horas. Los cultivos se lavaron con PBS estéril para eliminar las bacterias del medio. A partir de entonces, se añade gentamicina para eliminar los organismos extracelulares. Literatura previa de nuestro laboratorio utiliza inmunofluorescencia y microscopía confocal para determinar la localización del tejido bacteriana en diferentes puntos de tiempo después de la infección 2. Cultivos de órganos se enjuagan en PBS, se fijaron en 4% de paraformaldehído, y, o bien en medio OCT y se almacena a -80 ° C, o incluido en parafina y se almacena a temperatura ambiente embebido congelado. Las secciones de tejido pueden ser stained para inmunofluorescencia (IF) o análisis inmunohistoquímico (IHC) de las bacterias y la localización de células eucariotas. La Figura 2B es un representante si la imagen de una sección congelada preparado a partir de un 8,3 semanas de cultivo de órganos de las vellosidades en 72 hr después de la infección. Tenga en cuenta la pesada carga bacteriana (fluorescencia verde) en las EVT en los extremos de las ramas de las vellosidades, y la relativa falta de bacterias dentro de la capa de revestimiento del árbol-sincitiotrofoblasto (fluorescencia roja). En trabajos anteriores, se utilizó la tinción similar si se localice L. monocytogenes en los cultivos de órganos de las vellosidades en diferentes puntos de tiempo tras la infección. Más de 72 horas, la infección se extendió desde EVT en citrofoblastos sub-sincitial y el estroma de las vellosidades subyacente. En particular, la capa de synyctiotrophoblast era resistente a la infección 2.
Representativos imágenes de microscopía óptica de secciones de tejido decidual incluidos en parafina teñidas con H & E preparan a partir de 14,3 semanas specimens se muestran en las figuras 3B y 3C. Esta membrana transwell ECM-revestido se incrusta para mostrar el cultivo de órganos in situ (Figura 3B). La imagen muestra glándulas revestidas de epitelio (asterisco) y la vasculatura endotelial forrado (diamante) posicionados de forma heterogénea dentro del compartimento de células del estroma decidual. Además, hay células inmunes maternas repartidos por todo el estroma decidual a una densidad variable. IHC e IF tinción puede ser utilizado para determinar la localización microanatómico bacteriana, con relación a las células inmunes residentes específico. Como un ejemplo, los macrófagos CD14 + (fluorescencia verde) se localizan en el revestimiento de la vasculatura y se dispersan dentro de la estroma (Figura 3D), mientras que los grandes agregados de L. monocytogenes (fluorescencia roja) se observó principalmente en el estroma decidual a las 48 horas después de la infección (Figura 3D).
| tampón de lavado | medio Collection | medio de las vellosidades | medio decidual |
| PBS | DMEM / F-12 con GlutaMAX | DMEM / F-12 con GlutaMAX | DMEM / F-12 con GlutaMAX |
| La penicilina 100 UI / ml | Suero bovino fetal al 2,5% | Suero bovino fetal al 20% | Suero bovino fetal al 2,5% |
| Estreptomicina 100 mg / ml | La penicilina 100 UI / ml | La penicilina 100 UI / ml | 17β-estradiol de 300 pg / ml |
| La gentamicina 50 mg / ml | Estreptomicina 100 mg / ml | Estreptomicina 100 mg / ml | Progesterona 20 ng / ml |
| La anfotericina B 1,25 g / ml | La gentamicina 50 mg / ml | ||
| < / Td> | La anfotericina B 1,25 g / ml |
Tabla 1:. Recetas de medios Componentes y concentraciones para la preparación de tampón de lavado, medio de recogida, medio de las vellosidades y medio decidual.
Figura 1. placentario estructura. (A) Estructura de la unidad feto-placentaria en el útero materno, (B) Ampliación de la caja en (A) destaca que trofoblasto fetal (T) forrado vellosidades placentarias se bañan en sangre materna y anclados en la decidua por trofoblastos extravillous (EVT). Contenido dentro de vellosidades son vasos fetales (FV), fibroblastos, macrófagos y fetales. Modificado de Zeldovich y Bakardjiev 22. "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cultivos de órganos vellosos - Representante bruto e imágenes microscópicas (A) Dos árboles de las vellosidades terminales con una edad gestacional de 6 semanas, como se observa bajo un microscopio de disección.. Tenga en cuenta los extremos "suaves" (puntas de flecha) y prominente vasculatura fetal que cursan a través de las ramas del árbol de la izquierda lo que hace de esta pieza adecuada para el cultivo de órganos. (B) La inmunofluorescencia de cultivo de órganos (edad gestacional 8,3 semanas) después de la infección de 72 horas con Listeria monocytogenes, destacando pesada carga bacteriana [verde] en trofoblastos extravillous. DAPI se muestra en azul, y ßhCG + sinciciotrofoblastos en rojo. Barras de escala = 1 mm (A), 250 m (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Decidual cultivo de órganos - Representante bruto y las imágenes microscópicas (A) decidua parietal [izquierda] y decidua capsular [derecha] a la edad de 6 semanas de gestación, tal como se observa bajo un microscopio de disección. Sección teñida-E (B) H & de cultivo de órganos 14,3 semanas de gestación decidua parietal edad muestra glándulas y vasos organizados de forma heterogénea a lo largo estroma decidual. El (diamante, ◆) y el (asterisco, *) destacan buque representativa y la glándula, respectivamente. línea marrón en el borde inferior de la membrana es transwell, en el borde. (C) H & E-manchado sección de 14,3 semanas de edad gestacional decidua parietal cultivo de órganos a mayor aumento demonstrates arterias espirales musculares de paredes incrustadas en el estroma decidual. Las células inmunes maternas son pequeñas con núcleos redondos oscuros, y se distribuyen de manera irregular a lo largo del estroma. (D) La inmunofluorescencia de cultivo de órganos de 48 horas después de la infección con L. monocytogenes, destacando grandes zonas de bacterias [rojo] en el estroma decidual, y CD14 + maternos macrófagos [verde] bordean un espacio vascular tortuosa y dispersos en el estroma. Las barras de escala = 1 mm (A), 250 mm (B), 50 micras (C y D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Endogámicos, transgénicos y ratones knockout cepas pueden servir en sistemas experimentales para probar robustamente mecanismos. Sin embargo, a pesar de la conservación general de material genético núcleo, los genomas funcionales de ratones y seres humanos demuestran diferencias significativas en los elementos de regulación 23. No es sorprendente, por lo tanto, que los estudios preclínicos prometedores en modelos animales son a veces no se recapitulan en pacientes humanos. La placenta muestra muy alta diversidad entre especies, lo que hace por lo tanto modelos animales menos ideal para el estudio de enfermedades humanas 24. Reconociendo tanto las diferencias notables en inmunología humana y el ratón 25, y la evolución divergente pronunciada en la anatomía de la placenta, es prudente considerar el uso de cultivos de órganos ex vivo de tejidos gestacionales humanos para la investigación experimental.
Las descripciones, imágenes fotográficas y de vídeo de instrucción en este protocolo instruyen a los investigadores enla forma de establecer las vellosidades y cultivos de órganos deciduales en insertos de cultivo de tejido Transwell ECM-revestido. Las ventajas de esta técnica son la relativa simplicidad de la micro-disección y sistema de apoyo transwell mecánica, especialmente en comparación con métodos alternativos tales como matrices incrustados-3D o cultivos de cortes de órganos. La suspensión del cultivo de órganos de soporte de membrana permite el intercambio de nutrientes en todas las superficies de los tejidos y la viabilidad se mantiene para cultivo a corto plazo (96 horas para los cultivos de las vellosidades, 72 hr para las culturas deciduales) .Esta técnica permite el estudio de la biología de la placenta humana en el tejido nivel, sin lugar a dudas más biológicamente relevante que los modelos de cultivo celular monocapa.
El paso más crítico en este protocolo es la micro-disección de las piezas de las vellosidades y decidua apropiadas para el cultivo de órganos. Piezas óptimos de tejido se demuestran fotográficamente (Figura 2A y la figura 3A) para ayudar a los investigadores para quienesvisualización de especímenes gestacional es nueva. Es particularmente importante seleccionar árboles vellosos cuyas ramas terminan en columnas EVT, ya que estas células migrarán en el ECM y ayudar a anclar las vellosidades a la membrana. Para ambos tipos de cultivos de órganos es útil para reducir al mínimo las perturbaciones en el tejido durante los cambios de los medios de comunicación por pipeteo de una manera cuidadosa y sin prisas.
Esta técnica presenta dificultades mínimos. En ocasiones, las muestras muestran la contaminación. La contaminación bacteriana es generalmente (en ocasiones poli-microbiana), y sólo se hace evidente después de 1-2 días de cultivo. Una vez que se observa contaminación, la lejía se debe aplicar, la cultura descarta y la incubadora de cultivo de tejidos esterilizados para evitar un problema a largo plazo. Hay varias maneras posibles podría surgir la contaminación: la infección en el útero, durante la cirugía, durante la cosecha de especímenes / procesamiento, o durante el mantenimiento de cultivo de órganos. Las etapas de cosecha y procesamiento son el momento más probabley el lugar de la contaminación que se introducirá. Por lo tanto, es importante reducir la cantidad de tiempo se manipula el espécimen durante la recogida y micro-disección. Esto reducirá exposición de las muestras a la ambiente, el medio ambiente no estéril. Dependiendo de la configuración de laboratorio, el microscopio de disección se puede situar dentro de la campana de cultivo de tejido estéril.
El análisis histopatológico de cultivos de órganos después de la infección con el patógeno médicamente relevante L. monocytogenes, se muestra aquí como una posible aplicación del protocolo. Inmunofluorescencia localización de ambas bacterias y células inmunes del huésped después de la infección produce nuevos conocimientos sobre la respuesta del huésped humano a los patógenos. Cultivos de órganos deciduales pueden servir como una técnica complementaria ex vivo experimento para examinar los datos generados a partir de las infecciones de ratones in vivo, incluidos los informes intrigantes que muestran defectos en las funciones de defensa de los macrófagos murinos deciduales 26,27. Además, org humanaun culturas se pueden utilizar en las estrategias de infección mixta, tal como un inóculo competitiva compuesta de varias cepas isogénicas de L. monocytogenes. infección competitiva de los cultivos de órganos es una manera sensible para probar la relevancia de los factores de virulencia en el huésped humano. Una limitación de este método es la viabilidad del tejido, que se limita a cultivo a corto plazo (96 horas para los cultivos de las vellosidades, 72 hr para las culturas deciduales). Esto es ideal para la infección con microbios de rápido crecimiento como L. monocytogenes, pero las culturas más largos pueden ser necesarios para los patógenos que toman más tiempo para establecer y difundir a través del tejido.
Para reducir la carga global de las complicaciones del embarazo, la investigación debe centrarse en la comprensión de la fisiopatología de la interfase materno-fetal humano. Infecciones bacterianas, fúngicas y virales patógenos que cruzan la madre al feto causa devastadoras complicaciones del embarazo y la infección fetal. Controlado infección in vivo de laboratorio animals normalmente se considera el estándar de oro para abordar cómo los patógenos colonizan y tránsito entre los órganos 28. Debido a la anatomía de la placenta varía considerablemente de una especie de mamífero, que es de suma importancia para incorporar los tejidos humanos en las estrategias de investigación. cultivos de órganos de las vellosidades y decidua humanos son sistemas modelo de gran relevancia para investigar la interacción huésped-patógeno. Para el estudio de este órgano vital aún poco conocidos, los investigadores pueden aprovechar la abundancia de la placenta humana descartados y los especímenes deciduales, el uso de estrategias de cultivo de órgano, como se describe aquí.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. Pathology of the Human Placenta. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A.
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I.
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
