세포의 잘못 폴딩 된 단백질의 분해에 대한 분석
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
단백질은 세포 내에서 가장 풍부한 거대 분자이며, 이들은 거의 모든 생물학적 과정에서 중요한 역할을한다. 대부분의 단백질의 생물학적 활성에 자신 폴딩 필요하며, 천연 입체 구조를 유지. 비정상적인 단백질 입체 형태로는 정상적인 기능을 상실 할뿐만 아니라 자주 다른 단백질의 기능을 저해 세포 독성에 1,2- 수용성 올리고머 종 또는 응집체를 형성하지. 단백질 미스 폴딩 대응하기 위해 세포는 잘못 접힌 단백질 (3)을 제거하는 두 분자 그 나라의 형태에 도달하기 위해 펼친 또는 부분적으로 접힌 폴리 펩타이드를 지원 보호자, 및 분해 경로를 사용합니다. 복잡성과 폴딩 과정의 확률 적 특성상, 단백질 미스 폴딩은 불가피하며, 이는 돌연변이 생합성 오류 및 번역 후 손상 한 경우에 반전 될 수 없다. 따라서, 세포는 궁극적으로 degradat에 의존이온 통로 단백질은 품질을 유지한다.
세포 단백질의 품질 관리의 중요성 (PQC) 시스템은 암, 당뇨, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 근 위축성 측삭 경화증, 헌팅 톤병 (HD)와 같은 다수의 신경 퇴행성 장애를 포함한 단백질 미스 폴딩 질환의 보급에 의해 강조되고 척수 소 뇌성 운동 실조증 (SCA) 4,5. 예를 들면, p53 유전자의 돌연변이는 모든 경우 6 % – 50-70과 연관된 종양에서 가장 자주 유전자 병변이다. p53의 돌연변이의 실질적인 응집체 분획 (7)의 형성으로 이어지는 p53과의 형태를 변경 과오 돌연변이이다. 또한, 확장 된 polyQ 뻗어와 단백질은 유전자 및 병리 HD 및 SCA와 연결되어 있습니다. 영향을받는 단백질의 polyQ 스트레칭의 길이가 특정 Thres를 초과하면이 진보적이고 자주 치명적인 질병 매니페스트보유하고 polyQ 스트레칭의 길이가 8 연장으로 점점 심각해진다.
이들 질환을 치료하기위한 매력적인 방법은 치료 PQC 셀룰러 시스템, 특히 열화 경로를 강화하기위한 것이다. 그러나, 결함이있는 단백질, 포유 동물 세포에서, 특히 이들의 분해에 관여하는 경로가 제대로 이해 남아. 는 프로 테아 좀이 잘못 접힌 단백질의 분해 매우 중요하다는 것을 인식되었지만, 중요한 문제는 정의되지 않은 남아 : 구체적으로 인식 저하를 대상으로하는 방법을 잘못 접힌 단백질. PQC 시스템은 세포질, 소포체 및 미토콘드리아를 포함한 세포 구획에서 확인되었지만 또한, 핵의 PQC 시스템이 불분명 남아있다.
우리 연구소의 최근 연구는 핵으로 잘못 폴딩 된 단백질의 다양성을 인식하고 분해 시스템을 확인한의 포유 동물 세포 9. 이 시스템은 전 골수성 단백질 (PML), 핵 단백질과 노사정 모티브 함유 (TRIM) 단백질 가족의 구성원, 그리고 RNF4, 단백질을 포함하는 RING 도메인으로 구성되어 있습니다. PML 및 다른 여러 TRIM 단백질은 단백질 SUMOylation (10)의 특이성 및 효율을 촉진 SUMO (소 유비퀴틴 같은 개질제) E3 리가 아제 활성을 갖는다. RNF4 그들에게 유비퀴틴 리가 활동 (11)을 준다 링 도메인 이외에 하나 이상의 스모-상호 작용 모티브 (심즈)를 포함 SUMO-대상 유비퀴틴 리가 (STUbL)의 작은 그룹에 속한다. 우리는 PML 특별히 잘못 접힌 단백질에 고유 한 기능을 식별 할 수있다 분리 된 기판 인식 사이트를 통해 잘못 접힌 단백질을 인식하는 것으로 나타났습니다. 바인딩시에, PML 태그 내부 SUMOylation 사이트의 존재로 인해, 폴리 고리를 형성 할 수 SUMO2 / 3의 다결정 체인 거의 동일한 두 개의 포유류 SUMO 단백질과 단백질 미스 폴딩. 에스UMOylated 잘못 접힌 단백질은 그들의 유비퀴틴과 프로 테아 좀 저하로 연결 RNF4에 의해 인식됩니다. 우리는 상기에서 PML 결핍 SCA 유형의 마우스 모델 1 (SCA1) (9)의 행동 및 신경 병리학 적 결함을 악화로 PML-RNF4 시스템은 신경 퇴행에 대한 보호를 위해 중요하다는 것을 보여 주었다.
단백질 수준을 조절할 수있는 다른 셀룰러 메커니즘에서 단백질 분해를 구별하기 위해, 단백질 회전율의 비율은 9를 측정 하였다. 단백질 회전율을 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 방법 중 펄스 추적 및 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 있습니다. 이 두 가지 방법은 시간이 지남에 따라 조사, 각각 번역-실력 세포와 번역 – 억제 세포에 대한 관심의 총 기존의 단백질에 대한 관심의 방사성 동위 원소 표지 단백질. 그러나, 병원성 및 미스 폴딩하기 쉬운 단백질 연구에 대한 주요 과제는 상기 단백질의 반감기는 매우 싸다 될 수 있다는NG. 예를 들어, Ataxin-1 Ataxin-7, 헌팅, α-시누 클레인 및 TDP-43 모두는 24 시간 이상에 9,12-16 (12)의 반감기를 갖는다. 이들 단백질을 형질 세포, 장기 번역 억제 생존 할 수 특히 잘못 접힌 단백질 때문에 그 자체가 세포에 독성이 높은 수 있기 때문에 이들 단백질의 느린 회전율은 CHX 체이스 분석의 사용을 배제. 동위 원소 표지와 펄스 추적 분석은 매우 집계-경향이 단백질 도전 할 수있다. 대부분의 펄스 체이스 분석은 방사성 표지 된 모든 다른 단백질로부터 관심의 단백질을 분리하는 면역 침전에 의존하고 있습니다. 이 절차는 일반적으로 부정확 한 SDS-PAGE 전기 영동으로 분석을하고, SDS-불용성 집계를 형성 할 수있는 동안 긴 면역 침전 및 세척 절차를 포함한다.
느린 회전율이 9 설명과 함께 여기 프로토콜은 핵 잘못 접힌 단백질을 분석하는. 82 glutamines (Atxn1 82Q)의 스트레칭을 포함 Ataxin-1 (Atxn1)의 병원성 형태는이 목적을 팔에 사용됩니다. 세포에서 발현되면, 핵 (도 1a)에 Atxn1 82Q의 미시적 형태 보이는 개재물의 개선 된 녹색 형광 단백질 (GFP) 융합. 펄스 추적 분석 Ataxn1 82Q의 반감기를 통해 18 시간 9 있음을 알 수있다. Atxn1 82Q는 기본 형태와 미스 폴딩 다른 특성의 입체뿐만 아니라 종 종으로 구성되어있다. 이들 종은 다른 속도로 분해되는 것으로, 따라서 개별적으로 분석해야한다. 에서 해물 Atxn1 82Q-GFP 발현 세포가 NP-40 수용성 (수용성 또는 NS 가능성 천연 단백질 또는 잘못 폴딩 올리고머 / 모노머 단백질을 나타내는)와 NP-40 불용성 (NI, 집계 / 미스 폴딩) 부분으로 분별된다. (; 가능성 무질서 응집체 SS) 또는 (SDS 내성 SR 후자는 또한 SDS 가용성으로 나눌 수있다 가능성 아밀로이드 피 브릴을) 분수 (그림 1B). 스케줄링 분획 면역 다음 여과 지연 분석에 의해 검출 될 수있는 반면에 SS 및 NS 분획 웨스턴 블 롯팅 한 다음 SDS-PAGE로 분석 될 수있다. CHX 체이스 세제 분류 방식을 조합 한 SS Atxn1 82Q의 반감기는 SS 분획 쉽게 인식되고 분해 될 수 있다는 것을 나타내는, NS Atxn1 82Q 총 Atxn1 82Q (도 2a)의 것보다 훨씬 짧다는 것을 발견 세포 9인치 따라서,이 방법은 잘못 폴딩 된 단백질의 동역학을 연구 및 분해 패턴을 비교하는 강력한 도구를 제공한다.
또한 미스 폴딩 된 단백질의 분해를 조절할 수있는 작은 고분자 화합물을 식별하기위한 고 처리량 스크리닝을위한 적합한 방법을 설명한다. 이 방법은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (LucDM) (17), 모델 샤페론 기판의 입체 형태 불안정화 변이에 기초한다. 우리는 퓨즈가핵 지역화 신호 (NLS)을 개발 LucDM 검출의 편의를 위해이 세포 구획에서 PQC 시스템을 조사하고 GFP (NLS-LucDM-GFP)합니다. 현미경 NLS-LucDM-GFP 형성 세포 (그림 3A)의 작은 비율에 표시 핵 집계. Atxn1 82Q, NLS는-LucWT –GFP 된 PML-RNF4 경로 9 SUMO2 / 3에 의해 수정 및 규제 NLS-LucDM-GFP-하지만 그 야생형 상대 유사합니다. SS 및 SR 종의 상대적인 양에 비해 최소 NS 있지만 NLS-LucDM-GFP는 아래 프로토콜 3에 기재된 조건을 이용하여, SS 및 SR 종을 형성한다. 분석을 단순화하기 위해, 우리는 SDS에게 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로합니다 (NS 및 SS 분획 모두 포함) 가용성 LucDM을 분석 할 수 있습니다. 중요한 CHX 체이스 분석은 SDS 수용성 NLS-LucDM-GFP의 반감기 LucDM 인식하고 열화 시스템의 특정 기판임을 시사는 야생형 카운터 파트 (도 3b)보다 훨씬 짧은 것으로 밝혀잘못 접힌 단백질.
LucDM-GFP의 열화 전체 형광 신호의 현저한 저하를 야기한다. 따라서, 우리는 마이크로 플레이트 형광 계 분석을 이용하여 세포 LucDM-GFP의 실시간 검출에 대한 프로토콜을 개발했다. 많은 높은 처리량 화면 (HTS) 시스템은 비정상적인 단백질 18 ~ 20에 의한 세포 단위 및 세포 생존을 수정하는 약물이나 유전자에 대한 개발된다. 그러나, 거의 HTSs은 특히 포유 동물 세포 저하를 대상으로 설계되었습니다. 이 프로토콜은 셀룰러 미스 폴딩 된 단백질 분해에 대한 단백질 발현, 최저 및 약물 치료 효과의 신속한 대규모 분석을위한 강력한 시스템으로서 기능한다. 우리는 이러한 두 미스 폴딩 된 단백질의 분석 프로토콜을 설명하는 아래의 예로서 HeLa 세포를 사용. 형질 전환 조건으로 시간 경과에 개별 세포주에 대해 최적화 될 필요가있을 수 있지만 분석은 또한, 다른 세포주에 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
잘못 폴딩 된 단백질의 분해를 조절하는 기전은 세포 단백질의 항상성 유지에 필수적이며, 그들은 가능성 신경 퇴행성 장애 및 기타 단백질 미스 폴딩 질환의 치료를위한 유용한 약물 표적을 나타낸다. 여기서, 미스 폴딩 된 단백질의 분해를 조사 분석은 병원성 Atxn1 단백질 (Atxn1 82Q)와로서는 핵 국부 루시퍼 라제 돌연변이 (NLS-LucDM)를 이용하여 설명한다.
분해 18 시간 이?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
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