This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Белки являются наиболее распространенными макромолекулы в клетках, и они играют важную роль практически во всех биологических процессах. Биологическая активность большинства белков требует их сворачивания в, и поддержание, родные трехмерные структуры. Белки с аберрантных конформации не только теряют свои обычные функции, но и часто образуют растворимые олигомерные виды или агрегаты , которые ухудшают функции других белков и являются токсичными для клеток 1,2. Для противодействия белка неправильного фолдинга, клетки используют как молекулярные шапероны, которые помогают развернутые или частично свернутых полипептиды , чтобы достигнуть их нативную конформацию, а также пути деградации, которые устраняют белки 3 неправильно упакованные. Учитывая сложность и стохастический характер процесса складывания, белок неправильного сворачивания неизбежно, и оно не может быть отменено в случае мутаций, биосинтетических ошибок и посттрансляционными повреждений 1. Следовательно, клетки в конечном счете полагаются на degradatионные пути для поддержания их качества белка.
Важность контроля качества клеточного белка (PQC) системы подчеркивается преобладанием белков неправильного сворачивания заболеваний, включая рак, диабет и многих нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона (HD), и спиноцеребеллярная атаксия (SCA) 4,5. Например, мутации в супрессора р53 является наиболее часто генетическое поражение в опухолях, ассоциированных с ~ 50-70% всех случаев 6. Значительная часть мутаций р53 являются миссенс – мутации , которые изменяют конформацию р53, что приводит к образованию агрегатов 7. Кроме того, белки с расширенными polyQ участками генетически и патологически связаны с HD и ЗОБ. Эти прогрессивные и часто смертельных заболеваний проявляется, когда длина polyQ участке в пораженных белков превышает определенный Thresудерживать, и становится все более и более серьезными , как длина polyQ участке пролонгирует 8.
Привлекательным подходом для лечения этих заболеваний является терапевтически укрепления клеточных систем PQC, особенно пути деградации. Тем не менее, вовлеченного пути к деградации дефектных белков, в частности, те, в клетках млекопитающих, еще мало изучены. Несмотря на то, что было признано, что Протеасома является критически важным для деградации белков неправильно свернутых, жизненно важный вопрос остается неопределенным: как неправильно уложенный белки специфически узнавали и целенаправленной деградации. Более того, хотя системы PQC были идентифицированы в клеточных компартментах , включая цитоплазму, эндоплазматический ретикулум и митохондрии, системы PQC в ядре остаются неясными 2.
Недавние исследования, проведенные нашей лаборатории выявили систему, которая распознает и деградирует различные белки неправильно свернутых в ядреклеток млекопитающих 9. Эта система состоит из промиелоцитарного белка (PML), ядерный белок и член трехстороннего мотива, содержащего (TRIM) семейства белков, и RNF4, кольцо-домен, содержащий белок. PML, и несколько других TRIM белки, обладают Сумо (маленький убиквитин-подобный модификатор) лигазы активность E3, облегчающий специфичность и эффективность белка SUMOylation 10. RNF4 принадлежит к небольшой группе сумо ориентированных на убиквитинлигаза (STUbL), которые содержат один или несколько сумо взаимодействующих мотивов (ВИМС) в дополнение к домену RING , что дает им деятельности убиквитин лигазы 11. Мы обнаружили, что PML специфически распознает неправильно упакованные белки посредством дискретных участков распознавания субстрата, который может различить различные функции на неправильно свернутых белков. После связывания PML-теги неправильно свернутых белков с поли-цепей SUMO2 / 3, два почти идентичных SUMO белков млекопитающих, которые могут образовывать поли-цепи из-за наличия внутреннего сайта SUMOylation. SUMOylated Неправильно свернутые белки затем распознаются RNF4, что приводит к их убиквитинирование и протеосомной деградации. Кроме того , мы показали , что PML-RNF4 система важна для защиты от нейродегенерации, так как дефицит в PML усугубляет поведенческие и нейропатологических дефекты модели мыши типа SCA 1 (СЦА1) 9.
Чтобы отличить деградацию белков от других клеточных механизмов , которые могут регулировать уровни белка, скорости оборота белка измеряли 9. Среди наиболее часто используемых методов для определения оборачиваемости белка импульса Погоня и циклогексимид (СНХ) Погоня. Эти два метода изучения с течением времени, соответственно, радиоизотопные-меченых белков интереса к письменным переводом опытными клеток и общего количества уже существующих белков, представляющих интерес для письменного перевода тормозится клеток. Тем не менее, одной из основных задач для изучения патогенных и неправильного сворачивания склонной белков является то, что период полураспада этих белков может быть чрезвычайно Loнг. Например, атаксина-1, атаксина-7, Huntingtin, α-синуклеина, и TDP-43 все имеют период полураспада более 12 до 24 часов 9,12-16. Медленные темпы оборот этих белков исключает использование анализа СНХ чейза, потому что клетки, несущие эти белки не могут выжить длительное ингибирование трансляции, особенно потому, что неправильно свернутых белков сами по себе могут быть очень токсичными для клеток. Анализ импульсно-Погоня с изотопной метки также может быть сложной задачей для белков, которые являются весьма агрегацию склонны. Большинство импульсов-чейз анализы полагаются на иммунопреципитации отделить интересующий белок от всех других протеинов, которые также радиоактивно мечена. Эта процедура обычно включает в себя длительные иммунопреципитации и мыть процедуры, в ходе которых SDS-нерастворимые агрегаты могут образовываться, что делает анализ с SDS-PAGE электрофореза неточной.
Вот протокол для анализа ядерных белков с неправильно упакованные медленно скорость оборота описывается 9, Патогенную форму из атаксина-1 (Atxn1) , который содержит участок 82 глутаминов (Atxn1 82Q) используется для этой цели 8. При экспрессии в клетках, улучшенный зеленый флуоресцентный белок (GFP) слияние Atxn1 82Q форм микроскопически видимых включений в ядре (рис 1А). Анализ импульсов погоня показывает , что период полураспада Ataxn1 82Q составляет более 18 ч 9. Atxn1 82Q состоит из видов с неправильно свернутых конформации различных характеристик, а также видов с нативной конформации. Вполне вероятно, что эти виды разлагаются с разной скоростью, и, таким образом, следует анализировать отдельно. Лизаты из Atxn1 82Q-GFP-экспрессирующих клетки фракционированию в NP-40-растворимый (растворимый или NS, вероятно, представляющих родные белки или неправильно упакованных мономерные / олигомерные белки) и (NI, агрегированный /) Неправильно свернутые порции NP-40-нерастворимых. Последние могут быть дополнительно разделены на SDS-растворимой (SS, вероятно, неупорядоченные агрегаты) или ДСН-резистентный (SR; вероятные амилоидные фибриллы) Фракции (рис. 1б) NS и SS фракции могут быть проанализированы с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга, тогда как SR фракция может быть обнаружен с помощью фильтра замедляющих анализов с последующим иммуноблоттингом. СНХ Чейза сочетается с методом фракционирования для моющего средства, и обнаружили , что период полураспада SS Atxn1 82Q значительно короче , чем у NS Atxn1 82Q и общей Atxn1 82Q (рис 2А), что указывает , что фракция СС может быть легко распознаваться и деградирует в клетках 9. Таким образом, этот метод представляет собой мощный инструмент для изучения динамики белков и неправильно свернутых сравнить их картину деградации.
Мы также описываем способ, который пригоден для высокопроизводительного скрининга для выявления макромолекулами или небольших соединений, которые могут модулировать деградацию неправильно свернутых белков. Этот метод основан на конформационно дестабилизированной мутанта люциферазы светлячка (LucDM) 17, модель шаперонного подложки. У нас есть предохранительd LucDM к ядерной локализации сигнала (NLS), чтобы исследовать системы PQC в этом клеточном отсеке, и GFP (NLS-LucDM-GFP) для удобства обнаружения. NLS-LucDM-GFP формы микроскопически видимые ядерные агрегаты в небольшом проценте клеток (рис. 3 , а ) Подобно Atxn1 82Q, NLS-LucDM-GFP-но не его дикого типа аналог NLS-LucWT-GFP-модифицируется SUMO2 / 3 и регулируется PML-RNF4 пути 9. NLS-LucDM-GFP, также образует SS и SR видов, хотя относительные количества СС и СР видов являются минимальными по сравнению с NS, с использованием условий, описанных в протоколе 3 ниже. Для упрощения анализа, мы только анализируют SDS растворимый LucDM (включая как NS и фракции SS) с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Важно отметить, что СНХ Чейза анализ показал , что период полураспада в ДСН-растворимой NLS-LucDM-GFP значительно короче , чем у его дикого типа аналога (рис 3B), предполагая , что LucDM является специфическим субстратом для системы , которая распознает и деградируетНеправильно свернутые белки.
Деградация LucDM-GFP вызывает значительное снижение общего сигнала флуоресценции. Таким образом, мы также разработали протокол для обнаружения в режиме реального времени клеточного LucDM-GFP с помощью анализа микропланшет флуоресценции на основе. Многие экран с высокой пропускной способностью (HTS) системы разработаны для лекарств или генов , модифицирующих клеточные агрегаты и жизнеспособность клеток , вызванных аномальным белков 18-20. Тем не менее, очень немногие HTSs специально разработаны для нацеливания деградации в клетках млекопитающих. Этот протокол служит надежной системой для быстрого и крупномасштабного анализа эффектов экспрессии белка, нокдаун, и медикаментозное лечение на клеточном неправильно свернутых деградации белка. Использование клеток HeLa в качестве примера, ниже мы опишем протоколы для анализа этих двух белков неправильно свернутых. Анализы могут быть также применены к другим линиям клеток, хотя условия Трансфекция и время, конечно, возможно, должны быть оптимизированы для отдельных клеточных линий.
Механизмы, которые регулируют процесс деградации белков неправильно свернутых необходимы для поддержания гомеостаза клеточных белков, и они, вероятно, представляют собой ценные цели препарат для лечения нейродегенеративных расстройств и других белков-неправильного сворачивания за…
The authors have nothing to disclose.
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |