Des dosages pour la dégradation des protéines mal repliées dans des cellules
Summary
This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.
Abstract
Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.
Introduction
Les protéines sont les macromolécules les plus abondants dans les cellules, et ils jouent un rôle essentiel dans pratiquement tous les processus biologiques. L'activité biologique de la plupart des protéines nécessite leur pliage dans et à maintenir les structures en trois dimensions d'origine. Les protéines ayant des conformations aberrantes non seulement perdent leurs fonctions normales, mais aussi forment fréquemment des espèces oligomères solubles ou des agrégats qui altèrent les fonctions des autres protéines et sont toxiques pour les cellules 1,2. Pour contrer mauvais repliement des protéines, les cellules utilisent les deux chaperons moléculaires, qui aident les polypeptides dépliés ou partiellement repliés pour atteindre leur conformation native, et les voies de dégradation, ce qui élimine les protéines mal repliées 3. Compte tenu de la complexité et de la nature stochastique du processus de pliage, mauvais repliement des protéines est inévitable, et il ne peut pas être inversée dans le cas des mutations, des erreurs biosynthétiques et dommages post-traductionnelles 1. Par conséquent, les cellules dépendent finalement de dégradatvoies d'ions pour maintenir leur qualité de protéines.
L'importance du contrôle de la qualité des protéines cellulaires (QPC) systèmes est mise en évidence par la prévalence des maladies des protéines repliement, notamment le cancer, le diabète, et de nombreuses maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Huntington (HD), et ataxie spinocérébelleuse (SCA) 4,5. Par exemple, des mutations dans le gène p53 suppresseur de tumeur est la seule lésion génétique le plus fréquemment dans les tumeurs, associée à ~ 50-70% de tous les cas 6. Une fraction importante de mutations de p53 sont des mutations faux – sens qui modifient la conformation de p53, conduisant à la formation d'agrégats 7. En outre, les protéines avec des étendues polyQ expansées sont génétiquement et pathologiquement associés à HD et SCA. Ces maladies progressives et souvent fatales manifeste lorsque la longueur du tronçon de polyQ dans les protéines concernées est supérieur à un certain Thresmaintenir, et devient de plus en plus grave que la longueur du tronçon de polyQ prolonge 8.
Une approche intéressante pour le traitement de ces maladies est de renforcer les systèmes cellulaires thérapeutiquement PQC, en particulier les voies de dégradation. Cependant, les voies impliquées dans la dégradation des protéines défectueuses, en particulier dans les cellules de mammifères, restent mal connus. Bien qu'il ait été reconnu que le protéasome est très important pour la dégradation des protéines mal repliées, un enjeu vital reste indéfini: comment les protéines mal repliées sont spécifiquement reconnus et ciblés pour la dégradation. En outre, bien que les systèmes PQC ont été identifiés dans les compartiments cellulaires , y compris le cytoplasme, le réticulum endoplasmique, et la mitochondrie, les systèmes PQC dans le noyau restent peu claires 2.
Des études récentes de notre laboratoire ont identifié un système qui reconnaît et dégrade une variété de protéines mal repliées dans le noyaudes cellules de mammifère 9. Ce système est composé de la protéine promyélocytaire (PML), une protéine nucléaire et un membre de la tripartite famille de protéines contenant le motif (TRIM), et RNF4, un RING-domaine contenant des protéines. PML, et plusieurs autres protéines TRIM, possèdent SUMO (petit modificateur de ubiquitine) activité ligase E3, ce qui facilite la spécificité et l' efficacité de la protéine SUMOylation 10. RNF4 appartient à un petit groupe d'ubiquitine ligases SUMO ciblées (Stübl), qui contiennent un ou plusieurs motifs de sumo interagissant (SIMS) , en plus du domaine RING qui leur offre l'activité ubiquitine ligase 11. Nous avons constaté que la PML reconnaît spécifiquement les protéines mal repliées à travers des sites de reconnaissance de substrat discrètes qui peuvent discerner des caractéristiques distinctes sur les protéines mal repliées. Lors de la liaison, les balises PML mal repliées des protéines avec des poly-chaînes de Sumo2 / 3, deux protéines de mammifères SUMO pratiquement identiques qui peuvent former des poly-chaînes en raison de l'existence d'un site SUMOylation interne. Sprotéines mal repliées UMOylated sont ensuite reconnus par RNF4, ce qui conduit à leur ubiquitination et la dégradation par le protéasome. Nous avons aussi démontré que le système PML-RNF4 est important pour la protection contre la neurodégénérescence, comme une carence en PML aggrave les défauts comportementaux et neuropathologiques d'un modèle de souris de type SCA 1 (SCA1) 9.
Pour distinguer la dégradation des protéines à partir d' autres mécanismes cellulaires qui peuvent réguler les niveaux de protéines, les taux de renouvellement des protéines a été mesurée 9. Parmi les méthodes les plus fréquemment utilisées pour déterminer le renouvellement des protéines sont la chasse d'impulsion et cycloheximide (CHX) chasse. Ces deux méthodes examinent au fil du temps, respectivement, les protéines de radioisotopes marqué d'intérêt dans les cellules de traduction de maîtrise et protéines totales préexistantes d'intérêt dans les cellules de la traduction inhibée. Cependant, un défi majeur pour l'étude des protéines pathogènes et mauvais repliement sujettes est que la demi-vie de ces protéines peut être extrêmement long. Par exemple, Ataxin-1, Ataxin-7, la huntingtine, α-synucléine, et TDP-43 ont tous une demi-vie de plus de 12 à 24 heures 9,12-16. Les taux de rotation lente de ces protéines empêchent l'utilisation de l'analyse de la chasse CHX parce que les cellules hébergeant ces protéines ne peuvent pas survivre traduction inhibition prolongée, en particulier parce que les protéines mal repliées eux-mêmes peuvent être très toxiques pour les cellules. L'analyse pulse-chase avec marquage isotopique peut également être difficile pour des protéines qui sont très sujettes à l'agrégation. La plupart des tests pulse-chase reposent sur immunoprécipitation pour séparer la protéine d'intérêt à partir de toutes les autres protéines qui sont également marqué radioactivement. Cette procédure comprend normalement immunoprécipitation et de lavage des procédures longues, au cours de laquelle les agrégats de SDS-insolubles peuvent se former, ce qui rend l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE inexacte.
Voici un protocole pour analyser les protéines mal repliées nucléaires avec un taux de rotation lente est décrit 9. Une forme pathogène de Ataxin-1 (ATXN1) qui contient un tronçon de 82 glutamine (ATXN1 82Q) est utilisé à cet effet 8. Lorsqu'elle est exprimée dans les cellules, une protéine fluorescente verte (GFP) , la fusion améliorée de formes ATXN1 82Q microscopiques inclusions visibles dans le noyau (figure 1A). Analyse de chasse Pulse révèle que la demi-vie de Ataxn1 82Q est plus de 18 h 9. ATXN1 82Q est composé d'espèces ayant des conformations mal repliées des caractéristiques différentes, ainsi que des espèces ayant une conformation native. Il est probable que ces espèces sont dégradés à des vitesses différentes, et doit donc être analysée séparément. Lysats de ATXN1 82Q-GFP exprimant les cellules sont fractionnés en NP-40 soluble (soluble ou NS, représentant probablement des protéines natives ou des protéines monomères / oligomères mal repliées) et (NI, agrégé / mal repliées) portions NP-40 insoluble. Ce dernier peut être divisé en SDS-soluble (SS; probables agrégats désordonnés) ou résistante au SDS (SR; fibrilles amyloïdes probables) Les fractions (figure 1B). NS et SS fractions peuvent être analysées par SDS-PAGE suivie par un transfert de Western, tandis que la fraction SR peut être détectée par des dosages filtre à retard suivie d'un immunotransfert. Poursuite de chlorhexidine est combiné avec le procédé de fractionnement par détergent, et a découvert que la demi-vie de SS ATXN1 82Q est beaucoup plus courte que celle de NS ATXN1 82Q et le total ATXN1 82Q (figure 2A), ce qui indique que la fraction SS peut être facilement reconnu et dégradé 9 dans des cellules. Ainsi, cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la dynamique des protéines mal repliées et de comparer leur schéma de dégradation.
Nous décrivons également un procédé qui est approprié pour le criblage à haut débit pour identifier des macromolécules ou des composés qui peuvent moduler la dégradation de protéines mal repliées. Cette méthode est basée sur un mutant conformationnelle déstabilisée de la luciférase de luciole (LucDM) 17, un substrat modèle de chaperon. Nous avons fusibled LucDM à un signal de localisation nucléaire (NLS) pour sonder les systèmes PQC dans ce compartiment cellulaire, et la GFP (NLS-LucDM-GFP) pour la commodité de détection. Formes NLS-LucDM-GFP microscopiquement agrégats nucléaires visibles dans un petit pourcentage de cellules (figure 3A). Semblable à ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-mais pas son homologue de type sauvage NLS-LucWT-GFP-est modifiée par Sumo2 / 3 et réglementée par la voie PML-RNF4 9. NLS-LucDM-GFP forme également SS et les espèces SR, bien que les quantités relatives des SS et des espèces SR sont minimes par rapport à NS, en utilisant les conditions décrites dans le protocole 3 ci-dessous. Pour simplifier l'analyse, nous n'analysons SDS LucDM soluble (y compris les SN et les fractions SS) par SDS-PAGE et Western blot. Surtout, CHX essai de chasse a montré que la demi-vie du SDS soluble dans NLS-LucDM-GFP est beaucoup plus courte que celle de son homologue de type sauvage (figure 3B), ce qui suggère que LucDM est un substrat spécifique pour le système qui reconnaît et se dégradeprotéines mal repliées.
La dégradation des LucDM-GFP provoque une baisse significative du signal global de fluorescence. Par conséquent, nous avons également mis au point un protocole pour la détection en temps réel de LucDM-GFP en utilisant un dosage cellulaire basé sur la fluorescence de microplaque. De nombreux systèmes d' écran à haut débit (HTS) sont développés pour des médicaments ou des gènes modificateurs agrégats cellulaires et la viabilité cellulaire provoquées par des protéines aberrantes 18-20. Cependant, très peu HTS sont spécifiquement conçus pour cibler la dégradation dans les cellules de mammifères. Ce protocole sert de système robuste pour l'analyse à l'échelle rapide et à grande des effets de l'expression des protéines, knockdown, et un traitement médicamenteux sur cellulaire dégradation des protéines mal repliées. En utilisant des cellules HeLa à titre d'exemple, nous décrivons ci-dessous les protocoles pour l'analyse de ces deux protéines mal repliées. Les analyses peuvent également être appliqués à d'autres lignées cellulaires, bien que les conditions de transfection et de déroulement dans le temps peuvent avoir besoin d'être optimisé pour des lignées cellulaires individuelles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les mécanismes qui régulent la dégradation des protéines mal repliées sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie des protéines cellulaires, et ils représentent probablement des cibles de médicaments utiles pour le traitement de maladies neurodégénératives et d'autres maladies en protéines repliement. Ici, les dosages qui examinent la dégradation de protéines mal repliées sont décrits, en utilisant une protéine pathogène ATXN1 (ATXN1 82Q) et un mutant nucléaire localisée de la lucifér…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11995-092 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10082147 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M8699 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | 45000232 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Boehringer Mannheim | 4693159001 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Living Colors GFP Monoclonal Antibody | Clonetech | 632375 | |
| Anti-Actin mAb Rabbit, IgG | Sigma-Aldrich | A45060-200UL | |
| Amino acids | Sigma-Aldrich | Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium | |
| Olympus IX-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus | IX71/IX81 | |
| 96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom | Sigma-Greiner | 89135-048 | |
| Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200® PRO | TECAN | Infinite 200® PRO | |
| Cellulose acetate membrane 0.2 µm | Sterlitech | CA023001 | |
| Prism 5 | GraphPad | Statistical analysis software |
References
- Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426, 884-890 (2003).
- Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
- Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53. Cell. 137, 413-431 (2009).
- Xu, J., et al. Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors. Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).
- Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Trinucleotide repeat disorders. Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).
- Guo, L., et al. A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration. Mol Cell. 55, 15-30 (2014).
- Chu, Y., Yang, X. SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins. Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).
- Janer, A., et al. PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins. J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).
- Bauer, P. O., et al. Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein. Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).
- Austin, J. A., et al. Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).
- Paxinou, E., et al. Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult. J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).
- Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, 879-884 (2011).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313, 324-328 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466, 1069-1075 (2010).
- Fortini, M. E., Bonini, N. M. Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer. Trends Genet. 16, 161-167 (2000).
- Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7, (2012).
- Wanker, E. E., et al. Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates. Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).
- McDonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics. 3, 173-179 (2014).
- Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome. EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).
- Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins. Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).
- Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release. Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).
- Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells. Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Chen, Q., et al. Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake. Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).
- Link, C. D., et al. Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide. The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).
