Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta – Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo – Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.
Introduction
Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umgesetzt. Zunächst identifizierten wir 12 Kandidaten Faktoren induzieren TSC Schicksal, wenn sie in MEFs überexprimiert. Später, die Faktoren Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 wurden für die ITSC Induktion 3 notwendig und ausreichend zu sein , identifiziert. Gleichzeitig fand eine andere Gruppe unabhängig Tfap2c, Gata3 und Eomes ausreichend, um MEFs zu konvertieren in iTSCs. Jedoch, dassStudie, die Zeit für die Transgen – Expression erforderlich ist , deutlich länger im Vergleich zu unserer Studie verschiedene Umwandlungskinetik anzeigt, wenn Ets2 vom transdifferentiation Cocktail 4 abwesend ist.
Herkömmliche fötalem Rinderserum (FBS) enthält Kultur induziert und Blastozysten abgeleitet Trophoblast Stammzellen beruht auf der Anwesenheit von Faktoren , die durch Wachstumsinaktivierten MEFs sezerniert 5,6. Während der Induktions ITSC werden diese Faktoren durch MEFs vorgesehen, die die vollständige Kombination von Transgenen fehlt und die nicht transdifferentiation laufen. Sobald jedoch einzelne ITSC Kolonien sind subkultiviert, benötigen sie Medien, die durch das Wachstum-inaktivierten MEF vorkonditioniert wurde. Von da an iTSCs können nach Standardprotokollen wie Blastozysten abgeleitet TSCs kultiviert und behandelt werden. Bemerkenswert ist , im Gegensatz zu Tanaka et al. 5, wir routinemßig Kultur TSCs und iTSCs ohne Gelatinieren Zellkulturschalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
