栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル
Summary
Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.
Abstract
トロホブラスト幹細胞（のTSC）哺乳類の発生における最初の細胞の運命決定の結果として生じます。彼らは、自己再生および栄養膜系譜のすべてのサブタイプに分化する、胎盤の胎児部分を生じさせる細胞集団を幹の生体内と同等の能力を保持し、in vitroで培養することができます。したがって、のTSCは、in vitroで胚体外細胞運命の決定に対する胎盤の開発および胚を研究するためのユニークなモデルを提供しています。以降、胚盤胞段階から、DNAメチル化とヒストン修飾からなる別個のエピジェネティックな障壁がしっかりと両方の系統を分離します。ここで、我々は完全に過剰発現マウス胚性線維芽細胞における栄養膜重要な調節因子TFAP2C、GATA3、EomesとETS2の一過性のことで、この系統の障壁を克服するためのプロトコルについて説明します。誘導された栄養膜幹細胞は自己再生が可能で、派生トロホブラスト幹細胞を胚盤胞とほぼ同じです私形態学、マーカー遺伝子の発現とメチル化パターンのn項。 in vitroおよびde vivoアッセイにおける機能は、これらの細胞が栄養膜系譜は倍数体栄養膜巨細胞を発生させ、胚盤胞に注入された場合、胎盤をキメラ化に沿って分化することが可能であることを確認してください。体細胞組織からトロホブラスト幹細胞の誘導は、この胚体外系統の遺伝的およびエピジェネティックな特性を研究するための新たな道を開き、それぞれの胚を破壊することなくトロホブラスト幹細胞株を生成する可能性を提供しています。
Introduction
最近、トロホブラスト幹細胞の変換にマウス胚性幹細胞のいくつかのアプローチを比較した研究では、全ての分析システムにおいて、系統変換が不完全のままであることを明らかにしました。代わりに誘導された栄養膜幹細胞（iTSCs）のいわゆる栄養膜幹細胞様細胞は、起源1の細胞運命のメモリを保持生成されています。ここでは、ITSC世代の異なるアプローチを行いました。マウス胚性線維芽細胞（MEF）2からの多能性幹細胞の直接誘導と同様に、iTSCsは直接分化した体組織から変換されています。まず、MEFにおける過剰発現された場合、TSCの運命を誘導する12候補因子を同定しました。その後、要因TFAP2C、GATA3、EomesとETS2はITSC誘導3のために必要かつ十分であることが確認されています。同時に、別のグループは、独立して、TFAP2C、GATA3及びEomesがiTSCs中のMEFに変換するのに十分であることがわかりました。しかし、その中で研究は、導入遺伝子発現のために必要な時間がかなり長いETS2に転換カクテル4に存在しない場合、別の変換速度を示し、我々の研究と比較されます。
誘導し、胚盤胞由来トロホブラスト幹細胞の培養物を含有する従来のウシ胎児血清（FBS）は、成長不活性化MEFの5,6によって分泌される因子の存在に依存しています。 ITSC誘導時には、これらの要因は、導入遺伝子の完全な組み合わせを欠いており、分化転換を受けていないのMEF、によって提供されています。しかし、一度個々のITSCコロニーは彼らが成長不活化したMEFによってあらかじめ調整されたメディアを、必要とする、サブ培養されます。そこから先、iTSCsを培養し、標準的なプロトコルに従って胚盤胞派生のTSCのように処理することができます。注目すべきは、細胞培養皿をゲル化することなく、田中ら 5、私たちが日常的に文化のTSCとiTSCsとは対照的です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介する4因子（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）ベースの分化転換プロトコルは、マウス胚性線維芽細胞から忠実に変換iTSCsを生成するために、信頼性の高い方法を提供しています。さらに、この方法はあるが、胚性線維芽細胞3に比べて効率の低下で、また出生後の尾の線維芽細胞に適用可能です。一般的に、初代線維芽細胞の品質は、分化転換の結果とケアの重要な要因は、初期継?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20°C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20°C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80°C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
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