Summary
Questo manoscritto descrive una tecnica di litografia morbida a base di ingegnerizzare matrici uniformi di tridimensionale (3D) tessuti epiteliali di geometria definita circondati da matrice extracellulare. Questo metodo è suscettibile di una grande varietà di tipi di cellule e contesti sperimentali e consente di high-throughput screening di replicati identici.
Introduction
Lo sviluppo dei tessuti epiteliali ramificati, noto come ramificazione morfogenesi, è regolata da, e fattori ambientali fisici derivati dalle cellule. Nella ghiandola mammaria, branching morfogenesi è un processo iterativo attraverso il quale guidata migrazione cellulare collettiva crea un'architettura ad albero. Il primo passo è la formazione gemma primaria dai condotti del latte, seguita da iniziazione ramo e l'allungamento 1,2. Invasione delle filiali in stroma circostante è indotta dal rilascio sistemico di ormoni steroidei alla pubertà. Nuovi germogli primarie poi iniziano dalle estremità dei rami esistenti, e questo processo continua a creare un albero epiteliale 3. Anche se molti importanti segnali biochimici sono state identificate, una comprensione globale dei meccanismi cellulari biologici che guidano questo complesso processo di sviluppo è attualmente carente. Inoltre, gli studi meccanicistici sulle influenze dei segnali specifici sono difficili da decostruire da esperimentimenti in vivo, come precisi perturbazioni spazio-temporali e misure spesso non sono possibili.
Tridimensionali (3D) le tecniche di coltura, quali la cultura tutto l'organo, organoidi primarie, e modelli di coltura cellulare, sono strumenti utili per indagare in modo sistematico i meccanismi alla base del tessuto morfogenesi 4-6. Questi possono essere particolarmente utile per determinare le influenze di fattori specifici singolarmente, ad esempio forze meccaniche e segnali biochimici, su una varietà di comportamenti cellulari, compresa la migrazione, la proliferazione e la differenziazione. 6 modelli di coltura cellulare Engineered, in particolare, facilmente abilitare la perturbazione delle singole cellule e loro microambiente.
Un tale modello di coltura utilizza un approccio microfabbricazione-based per ingegnerizzare modello tessuti epiteliali mammarie con struttura 3D controllato che in modo coerente e riproducibile formano rami che migrano collettivamente quando indotto con l'unafattori di crescita ppropriate. Il principale vantaggio del modello è la capacità di manipolare e misurare gli effetti di fattori fisici e biochimici, come modelli di stress meccanico, con elevata affidabilità statistica precisione. Questa tecnica, insieme alla modellizzazione computazionale, è già stato utilizzato per determinare il contributo relativo di segnali fisici e biochimici nel guida del normale sviluppo dei tessuti epiteliali mammarie e di altri epiteli ramificati 7-11. Qui presentato è un protocollo dettagliato per la costruzione di questi tessuti modello, che possono essere facilmente estese ad altri tipi di cellule e della matrice extracellulare (ECM) gel, e che serve come un potenziale strumento per il test di terapie.
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Protocol
1. preparazione di soluzioni
- Per preparare un 5 mg / ml soluzione di insulina, diluire l'insulina magazzino in polvere con 5 mm di acido cloridrico (HCl) in DH 2 O (500 mg di insulina in 100 ml di solvente). Preparare 100 ml di solvente con l'aggiunta di 50 ml di HCl concentrato a 100 ml di acqua distillata (DH 2 O).
- Per fare una soluzione 1x di PBS, diluire la soluzione madre 10x tampone fosfato (PBS) a 1x con dH 2 O in condizioni sterili.
- Preparare il polidimetilsilossano (PDMS) elastomero soluzione come segue: mescolare il prepolimero PDMS insieme con il catalizzatore in un rapporto di 10: 1 (w w).
- Preparare il terreno di coltura cellulare come segue: a 500 ml di Modified Eagle Medium azioni di Dulbecco: miscela di nutrienti F-12 (DMEM / F-12), aggiungere 10 ml di sterile siero fetale bovino (FBS), 500 ml di reagente di gentamicina, e 500 microlitri di 5 mg / ml di insulina.
- Per preparare l'1% di siero albumina bovina (BSA) in soluzione PBS 1x, aggiungere 1% (w: V) di polvere di BSA a 1x PBS e mescolare accuratamente.
- Per preparare un 4 mg / ml soluzione di tipo bovino neutralizzato collagene, aggiungere 50 microlitri 10x soluzione salina equilibrata di Hank (HBSS) tampone, 30 microlitri 0,1 N di idrossido di sodio (NaOH), mezzo di coltura cellulare 30 microlitri, e 400 ml di archivio collagene ad un freddo 1,5 ml provetta. Mescolare lentamente pipettando su e giù; evitare di introdurre bolle. Per rimuovere eventuali bolle, centrifugare brevemente la miscela a 4 ° C.
- Preparare una soluzione fissativa diluendo 16% paraformaldeide 1: 4 (v: v) in PBS 1x.
- Preparare una soluzione di etichettatura nuclei diluendo la soluzione madre nuclei di etichettatura 1: 1.000 (v: v) in PBS 1x.
- Preparare una soluzione salina tamponata con fosfato 0,3% e soluzione detergente (PBST) mescolando 1x PBS con 0,3% (v: v) detergente.
- Preparare tampone di bloccaggio diluendo capra siero 1:10 (v: v) nello 0,3% PBST.
- Preparare una soluzione di anticorpo primario per una particolare proteina di interesse diluendo primary anticorpi (per esempio, coniglio anti-adesione focale chinasi (FAK)) 1: 200 (v: v) in tampone di bloccaggio.
- Preparare una soluzione di anticorpo secondario diluendo un anticorpo coniugato sonda fluorescente (per esempio, capra anti-coniglio) 1: 1.000 (v: v) in tampone di bloccaggio.
2. Preparazione di francobolli elastomerici per micropatterning 3D
Nota: francobolli elastomerici sono realizzati con PDMS.
- Fare una soluzione PDMS allo stesso rapporto come descritto al punto 1.3 e mescolare accuratamente. Mettere il composto in una camera a vuoto per 15-30 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria che sono stati introdotti durante il processo di miscelazione.
- Versare la soluzione degasato in una plastica pesare barca o un piatto di Petri contenente un maestro di silicio che viene litografia modellato con le caratteristiche di geometria desiderata. Per ottenere risultati ottimali, curare la soluzione PDMS a 60 ° C per ~ 12 ore.
Nota: I maestri di silicio sono altamente personalizzabili; Questo protocollo utilizza strutture rettangolari con dimensioni di 50micron x 200 micron x 50 micron distanziati di 200 micron a parte. I maestri di silicio possono essere effettuate utilizzando tecniche di fotolitografia standard. Brevemente, un fotoresist a base epossidica è spin-rivestito sulla cima di un wafer di silicio. Una maschera dettaglio le caratteristiche desiderati del timbro è posto sulla parte superiore della fetta photoresist rivestite, che viene poi esposto a luce UV. Le caratteristiche desiderate non bloccate dalla maschera sono esposti alla luce e il fotoresist in questi luoghi diventa reticolato, mentre il resto del rivestimento photoresist è solubile e può essere lavato via. - Dopo il PDMS ha curato circa le caratteristiche desiderate sul master silicio, rimuovere le PDMS e master dal contenitore di plastica. separare con attenzione il PDMS dal wafer di silicio e rimuovere PDMS in eccesso provenienti da tutto le caratteristiche impresse con una lama di rasoio pulito.
- Ora tagliare il PDMS fantasia con le caratteristiche impresso in singoli timbri rettangolari (~ 8 mm x 5 mm), con una lama di rasoio. Conservare queste feature-side-up in un CLEuna capsula di Petri da 100 mm di diametro.
- Inoltre, utilizzare la soluzione PDMS descritto al punto 1.3 per rendere supporti per i francobolli rettangolari.
- Utilizzando un coater rotazione, diffondere ~ 2-3 g della soluzione PDMS uniformemente su 100 mm di diametro Petri e curare le PDMS per ~ 12 ore a 60 ° C come al punto 2.1. Poi, usando una lama di rasoio, tagliare lo strato sottile di PDMS in rettangoli (di ~ 5 mm x 2 mm).
Nota: due supporti sono necessari per ogni francobollo PDMS fatto in fase 2.3. I supporti possono essere memorizzati nei 100 mm di diametro Petri che contiene i PDMS francobolli. - Prima che i PDMS francobolli e supporti possono essere utilizzati per coltura cellulare, sterilizzare in immersione in 70% etanolo e secco utilizzando un aspiratore in un armadio biosicurezza (cappa di coltura cellulare).
3. Preparazione del 3D epiteliale tessuti
- In un armadio biosicurezza, aggiungere una goccia di circa 50 ml di 1% BSA in PBS all'inizio di ogni timbro. Posizionare la goccia coperto francobolli a 4 ° C per un minimum di 4 ore per assicurare che la BSA adsorbe sulla superficie del timbro.
- Aspirare soluzione BSA dalle PDMS francobolli.
- Lavare le superfici dei timbri due volte con mezzo di coltura cellulare (50 microlitri a lavaggio per provvisorie dovrebbero essere sufficienti), aspirando dopo ogni lavaggio.
- Maneggiare il PDMS francobolli e supporti sterilizzati utilizzando curve pinzette in acciaio inox. In un armadio biosicurezza, lay out uno di 35 mm di diametro piatto di coltura di tessuti per ogni timbro PDMS. In ogni piatto, stabiliscono due supporti PDMS separate da una distanza leggermente inferiore alla lunghezza delle PDMS francobolli.
- Utilizzando le pinzette, sterilizzare il maggior numero di vetrini circolari (15 mm di diametro, # 1) in quanto vi sono PDMS francobolli con il 70% di etanolo. Aspirare il liquido in eccesso dai vetrini mentre tenendole con le pinzette. Conservare i coprioggetti lavati in un 100 mm di diametro Petri piatto a parte.
- Dispensare ~ 50 ml di miscela di collagene in modo uniforme rivestire la superficie di ogni timbro PDMS.
- Raccogliereogni PDMS collagene rivestite timbro con le pinzette e delicatamente invertono. Abbassare i francobolli invertiti sulla parte superiore del PDMS supporti disposti in coltura tissutale da 35 mm di diametro elargiti tale che il collagene è tra il timbro e il fondo del piatto di coltura tissutale. Incubare le piastre a 37 ° C per 30 min.
- Distribuire ~ 50 microlitri della miscela di collagene rimanente su ciascuno dei coprioggetto circolari (in seguito, questi saranno posizionati sopra i tessuti ingegnerizzati loro incapsulare completamente in collagene) e incubare a 37 ° C per 30 min.
- Ottenere un 100 mm di diametro coltura di tessuti piatto contenente cellule epiteliali (es. EpH4 topo cellule epiteliali mammarie) al ~ 40% di confluenza. Aspirare il terreno di coltura delle cellule e lavare una volta con 10 ml di PBS 1X. Aggiungere 2 ml di tripsina per le cellule e incubare a 37 ° C per 5-10 min.
- Aggiungere 8 ml di terreno di coltura fresco al piatto coltura di tessuti contenenti cellule trypsinized, staccando eventuali cellule aderenti rimanenti dal piatto. Mescolare delicatamente pipettando e spostare la miscela di cellule in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 100 g per 5 min.
- Aspirare il supernatante dal tubo conico e risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura cellulare. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule per determinare la concentrazione della sospensione. Regolare il volume sospensione per ottenere una concentrazione finale di 10 ~ 6 -10 7 cellule / ml.
- Rimuovere i campioni di collagene gelificata dal termostato. Utilizzando le pinzette, sollevare delicatamente i PDMS francobolli dritto verso l'alto per staccarli dal collagene stampata e gettarli.
- Pipettare ~ 30 microlitri della sospensione cellulare concentrata sulla superficie di ciascun gel di collagene contenente cavità sagomate di geometria desiderata. Osservare le cellule al microscopio campo chiaro con un obiettivo 10X / 0.25 NA agitando delicatamente il lato piatti a lato di promuovere la cella di stabilirsi all'interno delle cavità. Le cavità devono essere riempiti entro ~ 5 min.
- per rimuovi cellule in eccesso intorno cavità, inclinare ciascun tessuto piatto di coltura su un lato ed erogare delicatamente ~ 400 microlitri terreno di coltura cellulare sulla superficie del gel di collagene. Aspirare il liquido e ripetere il lavaggio 1-2 più volte, controllando i gel di collagene al microscopio tra ogni lavaggio.
- Dopo che le cellule in eccesso sono state cancellate da tutto cavità cellulari pieno nello stampo collagene, posizionare le piastre di coltura dei tessuti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C per 15 min. Poi, con le pinze, capovolgere delicatamente il coprioggetto classe collagene rivestite e metterli in cima stampi collagene cellule ripiene che il collagene dalle coprioggetti forma un cappuccio sulle cavità cellula-riempita. Incubare i campioni a 37 ° C per 15 min.
- Una volta che i tappi di collagene hanno aderito allo stampo collagene cell-riempite, dispensare ~ 2-2.5 mezzo di coltura cellulare ml lentamente nel vetrino di vetro sopra i gel. Culture i campioni a 37 ° C per 1-3 giorni.
Nota:24 ore dopo la semina iniziale, i tessuti epiteliali possono essere trattati con fattori di crescita come il fattore di crescita epidermico (EGF) o fattore di crescita degli epatociti (HGF) per indurre ramificazione.
4. immunofluorescenza e Image Analysis
- Aspirare il terreno di coltura cellulare dai piatti di coltura di tessuti e aggiungere soluzione fissativa sufficiente a coprire i gel di cellule contenenti. Incubare i piatti a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore a 200 rpm.
- Aspirare il fissativo, riempire le piastre di coltura tissutale con 1x PBS, e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore a 200 rpm. Ripetere l'operazione due volte per tre lavaggi totali.
- Per etichettare i nuclei: Aspirare il PBS dal piatto di coltura tissutale e sostituirlo con una soluzione Hoechst. Incubare a temperatura ambiente per 15-20 minuti. Per colorare per FAK o di un altro indicatore che è rilevabile con gli anticorpi, passare al punto 4.5.
- Aspirare la soluzione di etichettatura nucleare e lavare la g cellule contenentiels tre volte con PBS 1x come nel passo 4.2. campioni macchiati possono essere conservati in 1x PBS a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Per colorare per una proteina di interesse: Aspirare il PBS dai piatti di coltura tissutale, aggiungere 300 ml di 0,3% PBST, e incubare il campione a temperatura ambiente per 15 min.
- Aspirare il PBS, coprire il gel con tampone di bloccaggio, e incubare su shaker (200 rpm) a temperatura ambiente per ~ 4 ore.
- Aspirare il tampone bloccante, coprire il gel con una soluzione di anticorpo primario e incubare su un agitatore a 200 rpm notte a 4 ° C.
- Aspirare la soluzione di anticorpo primario, aggiungere la soluzione PBST 0,3%, e incubare su un agitatore a 200 rpm a temperatura ambiente per 30 min. Aspirare il PBST e ripetere ogni 30 minuti per 3-4 ore.
- Ripetere i punti 4.7 e 4.8, questa volta incubazione con la soluzione di anticorpo secondario. Avvolgere le piastre di coltura dei tessuti con un foglio di alluminio per evitare photobleaching dell'anticorpo secondario. Dopo la Final lavaggio, campioni macchiati può essere memorizzato in 1x PBS a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Per visualizzare campioni, utilizzare un 10X / 0.30 obiettivo NA focalizzata sul piano di simmetria dei tessuti epiteliali.
- Per visualizzare i nuclei delle cellule, campioni di immagini fisse marcati con un marcatore nucleare utilizzando un obiettivo NA 10X / 0.30 sotto illuminazione UV.
- Per visualizzare campioni colorati per una proteina di interesse, immagine utilizzando un obiettivo 10X / 0.30 NA su un microscopio invertito a fluorescenza.
- Per creare mappe delle frequenze di proteine colorazione dei tessuti multipli (tipicamente 50 o più) di geometria iniziale identici, prima importazione ognuna delle immagini utilizzando il software di analisi di immagine standard (vedi Materiali) e convertirli in 8-bit in scala di grigi.
- Per soglia di queste immagini, convertirle in binario (cioè, mezzitoni / bianco e nero) per la definizione di un punto di taglio in scala di grigi; valori di grigio inferiori alla soglia diventano neri, e quelli sopra della soglia diventano bianchi. Poi, unireciascuna delle singole immagini binarie in una singola pila.
- Successivamente, registrare le immagini sovrapposte (cioè allineare o della partita) nel software di analisi. Molti pacchetti software di analisi delle immagini dotate di un plug-in di registrazione liberamente disponibile.
- Utilizzare ogni immagine in una pila come un modello per l'allineamento dell'immagine successiva, tale che le immagini nella intero stack sono allineate per propagazione. Infine, overlay (progetto) le immagini nella serie di immagini allineate sulla base di intensità media per formare una singola immagine con una mappa frequenza dei pixel. Questa immagine può quindi essere color-coded utilizzando un software di editing delle immagini di scelta 10,11.
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Representative Results
Schematica generale di mammaria microfabrication tessuto epiteliale
Uno schema generale della procedura microfabbricazione illustra il flusso di lavoro sperimentale è mostrato in Figura 1. Il risultato finale è un array di tessuti epiteliali della geometria identica e spaziatura che sono completamente incorporati all'interno di un gel ECM. Un esperimento rappresentativo utilizza EpH4 topo cellule epiteliali mammarie coltivate in un gel di collagene bovino di tipo ad una concentrazione di 4 mg / ml. Per garantire la massima qualità dei tessuti ingegnerizzati, le tecniche descritte nel protocollo devono essere seguiti attentamente. Figure 2a e 2b mostrano viste basso e ad alto ingrandimento di array di pozzi rettangolari che sono state modellate in un collagene di tipo I gel prima di semina delle cellule. La forma dei pozzetti è determinata dalla forma delle caratteristiche del master silicio. È importante sollevare the PDMS stampo verso l'alto dal collagene in modo da non alterare la geometria della cavità. Figura 2C mostra pozzetti rettangolari in una collagene di tipo I gel che sono stati riempiti con cellule epiteliali mammarie (cellule in eccesso sono stati lavati via dalla superficie del collagene). In questo esempio, ogni 200 micron x 50 micron ben rettangolare contiene circa 80-100 cellule.
L'aggiunta di fattori di crescita induce morfogenesi
24 ore dopo la semina, i tessuti possono essere trattati con fattori di crescita come HGF o EGF e coltivate per diversi giorni per modellare branching morfogenesi. In genere, i rami iniziano a formarsi già nel 4 ore dopo la stimolazione del fattore di crescita. La figura 3A mostra risultati rappresentativi rettangolari tessuti epiteliali mammarie all'interno di un collagene di tipo I gel 24 ore dopo la procedura di microfabbricazione, dopo di che cells hanno aderito al collagene e tra di loro. Senza rami sono osservate prima dell'aggiunta fattore di crescita. La figura 3B illustra un tessuto rettangolare rappresentativo che ha subito ramificazione 24 ore dopo l'aggiunta di HGF a 10 ng / ml. In questo caso, rami si verificano in corrispondenza delle estremità dei tessuti (contrariamente al centro), dove le cellule subiscono la massima sollecitazione meccanica 9. Molteplici i tessuti di geometria iniziale identica nello stesso gel possono poi essere ripreso per determinare le medie di popolazione di localizzazione degli sportelli e la lunghezza ramo, che consente l'analisi ad alta produttività.
Immunofluorescenza per visualizzare la localizzazione delle proteine
Immunofluorescenza degli array tissutali nel modello culturale ci permette di determinare la localizzazione delle proteine all'interno di un tessuto con elevata affidabilità statistica. Figura 4A mostra rapprerisultati rappresentative di una ramificazione rettangolare tessuto epiteliale mammaria macchiato di chinasi di adesione focale (FAK). Creazione di mappe delle frequenze di tessuti di geometria identica può essere utilizzato per visualizzare la localizzazione media spaziale delle proteine di interesse all'interno dei tessuti, che possono essere comparati alla localizzazione di altre proteine e dell'attività ramificazione. La figura 4B mostra una mappa della frequenza di colorazione media FAK per 50 tessuti che presentano FAK arricchimento ai lati corti dei tessuti rettangolari, dove ramificazione si verifica in genere.
Figura 1. Schema che illustra la procedura di microfabbricazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Le immagini scattate durante il processo di microfabbricazione. (A) Basso e (B) e ingrandimento di immagini ad alta a contrasto di fase di cavità rettangolari in collagene di tipo I creati utilizzando uno stampo elastomerico PDMS. (C) Cavità da (A) e (B) sono riempiti con cellule epiteliali mammarie. Barre di scala, 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. microfabbricazione tessuti sono sottoposti (A) immagine contrasto di fase di un rappresentante rettangolare tessuto 24 ore dopo microfabbricazione branching morfogenesi.. (B) immagine contrasto di fase di un retessuto rettangolare presentative che ha iniziato a subire ramificazione 24 ore dopo l'aggiunta di HGF a 10 ng / ml. frecce bianche indicano i rami di nuova formazione. Barre di scala, 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Immunofluorescenza dei tessuti microfabbricati. (A) colorazione immunofluorescenza per FAK in un tessuto epiteliale mammaria dopo ramo iniziazione. (B) Una mappa della frequenza di colorazione media FAK in 50 tessuti. Barre di scala, 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH (HL118532, HL120142, CA187692), il Packard Fondazione David e Lucile, la Camille & Henry Dreyfus Foundation, e la Burroughs Welcome Fondo. ASP è stato sostenuto in parte da un Charlotte Elizabeth Procter onorifico Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
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