Karakterisering av mänskliga monocythärledda dendritiska celler från Imaging Flow Cytometry: en jämförelse mellan två monocyt Isoleringsprotokoll
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
Dendritiska celler (DC) är viktiga mediatorer för de medfödda och adaptiva immunsystem. De fungerar att inducera primära immunsvar och underlätta utvecklingen av immunologiskt minne. Dessa celler är primärt ansvariga för antigeninfångnings, migration och T-cellstimulering och därför hänvisas till som professionella antigenpresenterande celler (APC) en .Manipulation av DC: er skulle kunna användas inom ett stort antal olika forskningsområden och inom klinisk miljö för att behandla olika inflammatoriska sjukdomar såsom hiv 6,7, cancer 8, autoimmuna sjukdomar 9, och allergiska reaktioner 10. DCs används också för substansmissbruk forskning för att lösa okända mekanismer och vägar såsom de som förknippas med alkoholberoende 11-14, narkotikamissbruk 13,15, och kombinationen av HIV-infektion och missbruk 16-19. Dessa pågående studier och framtida studier forskning jagn området immunologi gör in vitro generation av DCs extremt viktigt för forskning. Emellertid finns det flera svårigheter som är förknippade med isolering av DC: er från humant blod som de bara utgör 0,1-1% av de totala mononukleära blodceller 20.
Hittills några av de väl etablerade metoder för generering av DC: er in vitro består av plast eller glas vidhäftning av monocyter 21,22, densitetsgradientcentrifugering 23, specifik markör baserad separation, såsom magnetisk aktiverad cellsortering 22, fluorescensaktiverad cellsortering 24 positiv selektion av CD14 + monocyter använder dextran-belagda magnetiska nanopartiklar 25, och snabb isolering av höggradigt renade monocyter med fullt automatiserad negativ cellselektion 26. Men den bästa metoden för val förblir kontroversiell. Därför, för att förbättra DC generationens teknik, har flera metoder utvecklats i vilkarenheten hos dessa celler kan ökas avsevärt genom differentiering från renade CD34 + progenitorceller och monocyter isolerade från perifert blod mononukleära celler (PBMC) 27. Såsom nämnts tidigare, är en allmänt använd och populär metod för att generera som härstammar från monocyter dendritiska celler (MDDCs) för att undersöka förmågan hos monocyter att vidhäfta till glas eller plast (vidhäftning metod) 21,22,27. Vidhäftningen metoden är en snabb och enkel metod som inte kräver användning av komplicerad utrustning. Men några nackdelar med denna process inkluderar lymfocyter föroreningar, låg flexibilitet, och monocyt gående manipulation 28. En alternativ metod för att vidhäftningen metod är den magnetiska isolering av monocyter från de totala PBMC, särskilt med användning av en human monocyt anrikning kit, som är utformad för att isolera monocyter från PBMC genom negativ selektion 26. Under denna procedur, är oönskade celler riktade bort med tetramerantikroppskomplex och dextran-belagda magnetiska partiklar. Fördelen med denna isoleringsmetoden är att de oönskade märkta celler separeras med användning av en magnet medan målceller kan fritt hälldes av in i ett nytt rör utan behov av kolumner. Hittills med tillgängligheten av specifika monoklonala antikroppar som kan märka unika cellpopulationer har den magnetiska separationstekniken blir inte bara ytterligare en metod, utan en nödvändighet för isolering av sällsynta celler inom immunologi. Till exempel, tekniker såsom magnetisk cellsortering med kommersiellt tillgängliga paramagnetiska MACS-nanopartiklar har underlättat utvecklingen av nya metoder för forskning och kliniska tillämpningar 22,29. Dessutom har de senaste studier som jämför DC generationen från monocytvidhäftning och Mac teknikmetoder visade en högre DC renhet och livskraft med hjälp av MACS separerade monocyter 22,30.
Den aktuella studien presenteraren jämförelse mellan två metoder för generering av humana DCs från monocyter isolerade från PBMC: 1) monocyt isolering genom vidhäftning och 2) monocyt isolering genom negativ selektion med användning av en kommersiell mänsklig monocyt anrikning kit. Denna studie ger belägg för att den negativa selektions magnetiska separationsförfarande för att isolera monocyter genererar den högsta avkastningen av monocyter med inga signifikanta skillnader i monocyt livsduglighet jämfört med monocyter isolerade genom vidhäftning metod. I sin tur, efter sju dagar, monocyterna som isolerats genom magnetisk separation differentieras till MDDCs med signifikant högre proliferativ kapacitet och större mängd celler som uttrycker dubbla positiva (CD11c + / CD14 +) fenotyp utan att påverka MDDC viabilitet. Sammantaget skiljer den aktuella studien från tidigare studier som refereras ovan, eftersom det visar förmågan hos båda teknikerna samtidigt generera monocyter som kan tillväxa och differentiera till CD11c +MDDCs (> 70%) efter sju dagar i kultur utan att kompromissa deras livskraft. Dessutom ger den nuvarande strategin för första gången karakterisering av olika CD11c / CD14 MDDCs populationer av avbildning flödescytometri.
Sammanfattningsvis, eftersom DCs spelar en central roll när det gäller forskning inom immunologi, olika parametrar måste beaktas när man överväger hur de kommer och vilka metoder som används för att isolera och kultur dem in vitro. Därför syftar denna studie för att ge insikter om två olika metoder för monocyt isolering och hur dessa metoder differentiellt påverka monocyt lönsamhet och avkastning på sikt påverkar dendritiska celler livskraft, tillväxt, och fenotyp. Dessa fynd kommer att bidra mycket till området immunologi och kommer att ge ett detaljerat protokoll av DC isolering, rening, och karakterisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
den aktuella studien bygger på de kända svårigheterna att isolera och generera MDDCs från humant blod, som syftar till att ge en omfattande jämförelse av två väletablerade metoder för generering av MDDCs. Den första metoden jämfört är en känd traditionell metod för att generera MDDCs genom att utnyttja förmågan hos monocyter att vidhäfta till glas eller plast (vidhäftning metod) 21,22,27. Vidhäftningen Metoden är snabb och kostnadseffektiv, och inte kräver användning av komplicerad utru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
References
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines – past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus<sup>®</sup>. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. . The American Association of Immunologists (AAI). , (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. . Differential Blood Count. , (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i., Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
