Caractérisation des monocytes dérivées des cellules dendritiques humaines par imagerie cytométrie de flux: une comparaison entre deux protocoles monocytes d'isolement
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
Les cellules dendritiques (CD) sont des médiateurs essentiels des systèmes immunitaires innées et adaptatives. Ils fonctionnent à induire des réponses immunitaires primaires et faciliter le développement de la mémoire immunologique. Ces cellules sont principalement responsables de capture d' antigène, la migration et la stimulation des cellules T et sont donc appelées cellules comme professionnels présentant l'antigène (CPA) 1 .Manipulation des PED pourraient être utilisés dans un large éventail de domaines de recherche et dans le cadre clinique pour traiter différents des maladies inflammatoires telles que le VIH 6,7, le cancer, les maladies auto – immunes 8, 9 et 10 des réactions allergiques. DC sont également utilisés pour la recherche sur la toxicomanie afin de résoudre des mécanismes et des voies inconnues , tels que ceux associés à la dépendance à l'alcool 11-14, la dépendance aux drogues 13,15, et la combinaison de l' infection et de la substance VIH abus 16-19. Ces études en cours et les futures études de recherche in le domaine de l' immunologie faire dans la production in vitro de DC extrêmement important pour la recherche. Cependant, il existe plusieurs difficultés associées à l' isolement DCs à partir de sang humain comme elles ne constituent que 0,1 à 1% du nombre total de cellules mononucléées du sang 20.
À ce jour, quelques – unes des méthodes bien établies pour la production de CD in vitro consiste en plastique ou en verre adhérence des monocytes 21,22, la densité centrifugation gradient 23, séparation spécifique à base de marqueur tel que magnétique tri cellulaire activé 22, fluorescent tri cellulaire activé 24, sélection positive des monocytes CD14 + à l' aide de nanoparticules magnétiques dextran revêtues 25, et l' isolement rapide des monocytes hautement purifiés à l' aide de la sélection de cellule négative entièrement automatisé 26. Cependant, la meilleure méthode de choix reste controversé. Par conséquent, pour améliorer les techniques de génération de courant continu, plusieurs méthodes ont été mises au point, dans lequella pureté de ces cellules peut être fortement augmentée par la différenciation de cellules progénitrices CD34 + et les monocytes purifiés isolés à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) 27. Comme mentionné avant, une méthode largement utilisée et populaire pour générer monocytes des cellules dendritiques dérivées (de MDDCs) est d'explorer la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d'adhérence) 21,22,27. Le procédé d'adhérence est une méthode simple et rapide qui ne nécessite pas l'utilisation d'un équipement complexe. Cependant, certains inconvénients de ce procédé comprennent la contamination des lymphocytes, une faible flexibilité et de manipulation monocyte transitoire 28. Une méthode alternative à la méthode d'adhérence est l'isolation magnétique des monocytes à partir de PBMC totaux, en particulier avec l'utilisation d'un kit d'enrichissement de monocyte humain, qui est destinée à isoler des monocytes à partir des PBMC par sélection négative 26. Au cours de cette procédure, les cellules indésirables sont ciblées pour l'élimination de tétramèreles complexes d'anticorps et des particules magnétiques revêtues de dextrane. L'avantage de cette méthode d'isolement est que les cellules marquées non désirées sont séparés à l'aide d'un aimant tandis que les cellules cibles peut être versé librement au loin dans un nouveau tube sans qu'il soit nécessaire pour les colonnes. A ce jour, la disponibilité d'anticorps monoclonaux spécifiques qui peuvent étiqueter des populations de cellules uniques, la technique de séparation magnétique est devenue non seulement une méthode supplémentaire, mais une nécessité pour l'isolement de cellules rares dans le domaine de l'immunologie. Par exemple, des techniques telles que la cellule magnétique de tri disponibles dans le commerce avec paramagnétiques MACS-nanoparticules ont facilité le développement de nouvelles approches pour la recherche et les applications cliniques 22,29. En outre, des études récentes comparant génération DC à partir de méthodes monocytes d'adhérence et de la technologie MACS ont démontré une pureté et la viabilité plus élevée DC en utilisant MACS monocytes 22,30 séparés.
Les cadeaux de l'étude en coursune comparaison entre les deux procédés pour la production de CD humaines à partir de monocytes isolés à partir de PBMC: 1) l'isolement de monocytes par adhérence et 2) l'isolement de monocytes par sélection négative en utilisant un kit commercial d'enrichissement de monocytes humains. Cette étude fournit des preuves pour montrer que la procédure de sélection de séparation magnétique négatif pour isoler les monocytes génère le plus haut rendement de monocytes avec aucune différence significative dans la viabilité des monocytes par rapport aux monocytes isolés par la méthode d'adhérence. À son tour, au bout de sept jours, les monocytes isolés par séparation magnétique différenciées en MDDCs avec une capacité proliférative significativement plus élevée et plus grande quantité de cellules exprimant positive double (CD11c + / CD14 +) phénotype sans affecter CDMD viabilité. Dans l'ensemble, l'étude actuelle diffère des études antérieures mentionnées ci-dessus car elle démontre la capacité des deux techniques pour générer simultanément des monocytes qui sont capables de proliférer et de se différencier en cd11cMDDCs (> 70%) après sept jours de culture sans compromettre leur viabilité. En outre, l'approche actuelle prévoit la première caractérisation temporelle de CD11c différents / populations CD14 MDDCs par flux d'imagerie cytométrie.
En résumé, étant donné que les PED jouent un rôle central en ce qui concerne la recherche dans le domaine de l' immunologie, des paramètres différents doivent être pris en considération lors de l' examen comment ils sont dérivés et quelles méthodes sont utilisées pour isoler et les cultiver in vitro. Par conséquent, cette étude vise à fournir des indications sur deux méthodes différentes d'isolement des monocytes et comment ces méthodes affectent différemment monocytes la viabilité et le rendement peut éventuellement affecter la viabilité des cellules dendritiques, la prolifération et le phénotype. Ces résultats contribueront grandement au domaine de l'immunologie et fournira un protocole détaillé de DC isolement, la purification et la caractérisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sur la base des difficultés connues d'isolement et de générer MDDCs de sang humain, la présente étude vise à fournir une comparaison détaillée des deux méthodes bien établies pour la génération de MDDCs. La première méthode comparée est une méthode traditionnelle bien établie pour générer MDDCs en exploitant la capacité des monocytes à adhérer au verre ou en plastique (méthode d'adhérence) 21,22,27. La méthode d'adhésion est rapide et rentable, et ne nécessite pas l'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
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