Préparation et caractérisation des lipophile doxorubicine micelles Pro-drogue
Summary
Un protocole pour la préparation et la caractérisation de la doxorubicine lipophile pro-médicament chargé 1,2-distéaroyl sn – glycéro-3-phosphoethanolamine- N – [amino (polyéthylène glycol) -2000] (DSPE-PEG) micelles est décrite.
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
La chimiothérapie est couramment utilisé pour traiter diverses formes de cancers. La plupart, sinon la totalité, des médicaments de chimiothérapie ont des effets secondaires toxiques qui peuvent varier selon les conditions mineures administrable, tels que la nausée et de diarrhée, à des conditions plus menaçant la vie. Parce que la plupart des médicaments anticancéreux sont toxiques, l'exposition non sélective de ces médicaments à des tissus normaux provoque inévitablement la toxicité. Par conséquent, il y a un grand besoin d'une approche thérapeutique qui peut sélectivement délivrer des médicaments dans les cellules cancéreuses. Un autre défi à l'administration de médicaments anticancéreux est leur solubilité dans l'eau pauvre. Habituellement, des agents de solubilisation sont nécessaires pour formuler ces médicaments peu solubles. Cependant, la plupart des agents solubilisants, tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO), le Cremophor EL, et le polysorbate 80 (Tween 80) peut provoquer une toxicité hépatique et rénale, une hémolyse, des réactions d'hypersensibilité aiguë et des neuropathies périphériques. 1 Par conséquent, les formulations sûres et biocompatibles sont nécessaires pour l'utilisation clinique des pauvresmédicaments anticancéreux ly solubles. Nanocarriers sont prometteurs systèmes de délivrance de médicaments pour relever les défis ci-dessus. Ces nanocarriers comprennent des liposomes, 2 nanoparticules, 3 micelles, 4-7 conjugués polymère-médicament, 8 et des matériaux inorganiques. 9 Plusieurs produits de la nanomédecine (par exemple, Doxil, Abraxane, et Genexol) ont été approuvés par les organismes de réglementation pour traiter les patients atteints de cancer. dix
Les micelles polymériques sont prometteurs transporteurs de délivrance de médicaments à l' échelle nanométrique, qui ont été utilisés avec succès pour l'administration de médicaments anticancéreux. 4-7,11,12 micelles polymères typiques sont préparés à partir de polymères amphiphiles à travers un processus d' auto-assemblage. Les micelles polymères structurés à noyau-enveloppe comprennent une enveloppe hydrophile et un noyau hydrophobe. La coquille hydrophile peut stériquement stabiliser micelles et prolonger leur circulation dans le flux sanguin. Le noyau hydrophobe peut effectivement encapsuler d hydrophobetapis. En raison de la petite taille de micelles (typiquement inférieure à 200 nm) et des propriétés de longue circulation, les micelles polymères sont censés atteindre le ciblage tumoral grâce à une meilleure perméabilité et de rétention (EPR) effets (tumeur passive ciblage).
la stabilité de chargement de la drogue est critique pour la capacité de ciblage tumoral de micelles. Pour parvenir à un ciblage optimal des tumeurs, les micelles doivent avoir une fuite minimale de médicament avant d'atteindre le site de la tumeur, mais libérer rapidement le médicament après être entré dans les cellules cancéreuses. En outre, la stabilité de la formulation est également une condition essentielle pour le développement de produits, parce que la stabilité de la formulation détermine la faisabilité du développement des produits, ainsi que la durée de vie des produits développés. Récemment, beaucoup d'efforts ont été faits pour améliorer le chargement de la drogue dans les transporteurs de livraison. L'approche pro-médicament lipophile est une stratégie qui a été explorée pour améliorer la charge de médicament dans des nanoparticules lipidiques et émulsions. 13,14 Le conjugation de lipides avec des médicaments peut améliorer de manière significative leur lipophilie et améliorer le chargement et la rétention dans les composants lipophiles de nanocarriers.
Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation de la doxorubicine lipophile pro-drogue micelles chargées. Tout d'abord, la procédure de synthèse pour la doxorubicine pro-médicament lipophile est décrit. Puis, un protocole pour générer des micelles avec un procédé de film de dispersion est introduite. Cette méthode a été utilisée avec succès dans les études précédentes. 5 DSPE-PEG a été choisi en tant que matériau de support pour préparer des micelles parce qu'il a été utilisé avec succès pour la livraison micelle de médicaments. 15,16 Enfin, nous décrivons plusieurs essais in vitro utilisées pour caractériser micellaire Les formulations et d'évaluer l'activité anti-cancéreuse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce travail, nous décrivons une méthode film dispersion simple, rapide pour la préparation de micelles. Cette méthode utilise les propriétés d' auto-assemblage d'un polymère amphiphile (par exemple, DSPE-PEG) pour former des micelles structuré noyau-enveloppe dans un environnement aqueux. Cette méthode de préparation micellaire présente plusieurs avantages. 1. Il comprend un processus de formulation simple, ce qui évite l'utilisation de mesures de réduction de taille complexes (tell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
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