Получение и определение характеристик липофильных доксорубицина мицеллах пролекарством
Summary
Протокол для подготовки и определения характеристик липофильный доксорубицина пролекарства загружен 1,2-distearoyl- зп глицеро-3-phosphoethanolamine- N – [амино (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-PEG) мицеллы описывается.
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
Химиотерапия обычно используется для лечения различных форм рака. Большинство, если не все, химиотерапевтические препараты имеют токсические побочные эффекты, которые могут отличаться от управляемых второстепенных условий, таких как тошнота и диарея, более жизненных условий, угрожающих. Поскольку большинство противоопухолевые препараты токсичны, неселективные воздействие этих препаратов в нормальной ткани неизбежно вызывает токсичность. Таким образом, существует большая потребность в терапевтическом подходе, который может избирательно доставлять лекарства в раковые клетки. Еще одна проблема, с введением противоопухолевых препаратов является их плохая растворимость в воде. Как правило, солюбилизирующие агенты необходимы для разработки таких плохо растворимых лекарств. Тем не менее, большинство солюбилизирующие агенты, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), Cremophor EL, и полисорбат 80 (твин 80) может вызывать повреждение печени и токсичность почек, гемолизу, острые реакции гиперчувствительности и периферические невропатии. 1 Таким образом, безопасную и биологически совместимую составы необходимы для клиническое использование бедныхLY растворимые противоопухолевые препараты. Наноносителей перспективны системы доставки лекарственных средств для решения вышеуказанных проблем. Эти наноносителей включают липосомы, 2 наночастицы, 3 мицеллы, 4-7 конъюгатов полимер-наркотиков, 8 и неорганические материалы. 9 Несколько Наномедицина продуктов (например, Doxil, Abraxane и Genexol) были одобрены регулирующими органами для лечения онкологических больных. 10
Полимерные мицеллы являются перспективными нано-носителей для доставки лекарств, которые были успешно использованы для доставки противоопухолевых препаратов. 4-7,11,12 Типичные полимерные мицеллы получают из амфифильных полимеров с помощью процесса самосборки. Ядро-оболочка структурированные полимерные мицеллы включают гидрофильную оболочку и гидрофобную сердцевину. Гидрофильная оболочка может стерически стабилизировать мицеллы и продлить срок их циркуляции в кровотоке. Гидрофобным ядро может эффективно герметизировать гидрофобный дковрики. Из-за небольшого размера мицелл (обычно менее 200 нм) и свойства долгосрочной циркуляции, полимерные мицеллы, как полагают, для достижения опухолью ориентации посредством повышенной проницаемости и удерживания (EPR) эффекты (пассивный опухоль ориентации).
стабильность загрузки лекарственного средства имеет решающее значение для опухоли таргетирования способность мицеллы. Для достижения оптимальной адресности опухоли, мицеллы должны иметь минимальную утечку наркотиков до достижения место локализации опухоли, но быстро высвобождать лекарственное средство после введения раковых клеток. Кроме того, стабильность состава также является важным требованием для разработки продукта, так как стабильность состава определяет целесообразность разработки продукта, а также срок годности разработанных продуктов. В последнее время много усилий было сделано, чтобы улучшить загрузку препаратов в носителей доставки. Липофильная подход пролекарством является стратегия , которая была изучена , чтобы улучшить загрузку лекарственного средства в наночастицы липидов и эмульсий. 13,14 Призываниеugation липидов с наркотиками может значительно улучшить их липофильности и повысить загрузку и сохранение в липофильных компонентов наноносителей.
Здесь мы опишем протокол для подготовки липофильный доксорубицин пролекарственных нагруженные мицеллы. Во-первых, процедура синтеза доксорубицина липофильный пролекарства описан. Затем, протокол для генерации мицеллы с методом пленочного дисперсии вводится. Этот метод был успешно использован в наших предыдущих исследованиях. 5 DSPE-PEG был выбран в качестве материала – носителя для получения мицеллы , потому что он был успешно использован для доставки мицеллы наркотиков. 15,16 Наконец, мы опишем несколько анализов в пробирке , используемые для характеристики мицеллы препараты и оценить противоопухолевую активность.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой работе мы описываем несложный, быстрый метод пленочного дисперсии для получения мицелл. Этот метод использует свойства самосборка амфифильного полимера (например, DSPE-ПЭГ) с образованием ядро-оболочка структурированных мицеллы в водной среде. Этот метод мицеллярный препар?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
References
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?. ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
- Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
- Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd, ., D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
- Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
- Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
- Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
- Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
- Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
- Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
- Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
- Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2′-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
- Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
- Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
- Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
- Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
- Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
- Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
- Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
- Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
- Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).
