Murine Beugersehne Verletzung und Reparatur Chirurgie
Summary
Flexor Sehnen in der Hand sind häufig verletzt, zu einer Beeinträchtigung der Funktion der Hand führt. Allerdings ist die Narbengewebeheilungsreaktion nicht gut charakterisiert. Ein Mausmodell der Beugesehnenheilung wird hier demonstriert. Dieses Modell kann allgemeine Verständnis des Heilungsprozesses zu verbessern und therapeutische Ansätze zu bewerten, um die Heilung zu verbessern.
Abstract
Tendon verbindet der Skelettmuskulatur und Knochen, Bewegung fast den gesamten Körper zu erleichtern. In der Hand ermöglichen Beugesehnen (FTS) Beugung der Finger und die allgemeine Funktion der Hand. Verletzungen FTS sind häufig, und eine zufriedenstellende Heilung wird oft durch übermäßige Narbengewebe und Verwachsungen zwischen der Sehne und des umgebenden Gewebes beeinträchtigt. Es ist jedoch wenig über die molekularen und zellulären Bestandteile des FT Reparatur bekannt. Zu diesem Zweck ist ein murines Modell FT Reparatur, die viele Aspekte der Heilung beim Menschen, einschließlich gestörter Bewegungsbereich und verringerte mechanische Eigenschaften rekapituliert, entwickelt und oben beschrieben wurde. Hier eine eingehende Demonstration dieses chirurgischen Verfahrens ist vorgesehen, an denen transection und anschließende Reparatur des Flexor digitorum longus (FDL) Sehne im Maus-Hinterpfote. Diese Technik kann verwendet werden, lineage Analyse verschiedener Zelltypen zu führen, um die Auswirkungen von Gen-Gewinn oder Verlust-of-Funktion zu bewerten und die Effi zu testensamkeit von pharmakologischen Interventionen in den Heilungsprozess. Allerdings gibt es zwei primäre Einschränkungen zu diesem Modell: i) die FDL-Sehne im mittleren Teil des murinen Hinterpfote, wo der Durchtrennung und Reparatur auftreten, wird nicht von einer Synovialscheide umgeben. Daher ist dieses Modell nicht berücksichtigt den möglichen Beitrag der Hülle zur Narbenbildung Prozess. ii) Um die Integrität der Reparaturstelle zu schützen, wird die FT am Muskel-Sehnen-Übergang freigegeben, um die mechanischen Kräfte der Sehne abnimmt, wahrscheinlich zu einer erhöhten Narbenbildung beitragen. Isolation von ausreichender Zellen aus dem Granulationsgewebe des FT während des Heilungsprozesses zur Analyse durchflusszytometrischen hat sich als schwierig; Zytologie Zentrifugation diese Zellen zu konzentrieren, ist eine alternative Methode verwendet wird, und ermöglicht es zur Erzeugung von Zellpräparationen, auf dem Immunofluoreszenz Kennzeichnung durchgeführt werden kann. Bei diesem Verfahren wird die Quantifizierung von Zellen oder Proteine von Interesse während FT Heilung möglich.
Introduction
Flexor Sehnen in der Hand arbeiten gemeinsam mit den Beugemuskeln des Unterarms und digitale Scheiden Beugung der Ziffern und Greiffunktion der Hand zu ermöglichen. Beugesehnen entlang der Palmarseite der Hand laufen; Diese relativ oberflächliche Lage führt oft zu Verletzungen an den Beugesehnen während eines Traumas auf der Hand. Sehnen heilen durch eine Reaktion von Narbengewebe statt Regeneration von normalen Sehnengewebe 1. Während diese Narbengewebe Kontinuität der Sehne bereitstellt, wird Funktion verringert sich dramatisch auf gesunde Sehne relativ. Tendon-Narbengewebe Komposite werden durch beeinträchtigte mechanische Eigenschaften 1, dadurch die reparierten Sehnen eher zu Bruch zu machen. Darüber hinaus mangelt es Narbengewebe, die Organisation der nativen Sehnenkollagen Faserstruktur, was zu einer Erhöhung der Sehne Größe und Masse. die anatomischen Einschränkungen der Sehnenscheide Einheit, selbst eine bescheidene Zunahme der Sehne Größe drastisch rot GegebenUCE die Gleitfunktion der Sehne und damit der Bewegung und Handfunktion einstelligen Bereich.
Vor der Verletzungen von 1960 an die Beugesehnen, insbesondere solche , in Zone II der Hand wurden nicht routinemäßig wegen der schweren Komplikationen bei der Heilung repariert , die 2 mit diesen Reparaturen entstanden sind . Dieser Bereich der Hand wurde als "Niemandsland" 3 bezeichnet. Allerdings Verbesserungen in der chirurgischen Techniken, Nahtmuster und physikalische Therapie Rehabilitation Protokolle haben sich dramatisch Ergebnisse der Beugesehne Reparaturen verbessert 2. Trotz dieser Fortschritte bis zu 40% der Reparaturen führen in ausreichender Adhäsionsbildung Handfunktion 4 zu behindern. Daher wird eine biologische Ansatz erforderlich Heilung zu verbessern. Leider ist nur sehr wenig auf zellulärer und molekularer Ebene über die Sehne Heilungsprozess bekannt. Somit war das Ziel, ein Mausmodell zu entwickeln, die verwendet werden könnten, die grundlegende understandin zu verbesserng der zellulären und molekularen Komponenten der flexor tendon Heilung und Narbenbildung Antwort als Mittel neue therapeutische Targets zu identifizieren, die Heilung zu verbessern.
Größere Tiermodelle haben dazu beigetragen, bei der Förderung Verständnis des Prozesses der Heilung Beugesehne. Hunde- und Kaninchen Studien haben sowohl die intrinsische als auch extrinsische Heilungsfähigkeit der Beugesehnen 5,6 gezeigt, die Bedeutung einer frühzeitigen passiven Bewegung gesteuert bei der Minimierung von Adhäsionen in Bezug auf die Immobilisierung 7, sowie die Auswirkungen unterschiedlicher Nahtmuster auf den Heilungsprozess 8 9. Darüber hinaus hat das canine Modellansätze in Prüfung translatorische gewebe Engineering nützlich gewesen 10 die Heilung zu verbessern. Allerdings gibt es mehrere wichtige Vorteile in einem murinen Modell relativ zu einem Großtiermodell verwenden, einschließlich der relativen Kosten, Verfügbarkeit von murinen spezifischen Reagenzien und die Leichtigkeit des Erzeugens globalen Knock-outs oder gewebespezifische Löschen / Überexpression Konstrukte. Darüber hinaus zeigen die funktionellen Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Mäusen in Bezug auf Beugesehnen 11 die potentiellen Nutzen eines Mausmodells zu entwickeln.
Entwicklung eines Mausmodell der Beugesehne durchtrennt und die Reparatur imitiert viele Aspekte der klinischen Heilung, einschließlich der Bildung von Narbengewebe reichlich vorhanden und die Beeinträchtigung der mechanischen Eigenschaften. Das hier beschriebene Modell ist keine echte Reprise der klinischen Praxis aufgrund Trennung der FDL am Muskel-Sehnen-Übergang, um die Reparaturstelle zu schützen. Darüber hinaus ist Konto dieses Modell nicht für den Beitrag der Synovialscheide Zellen zur Heilung Antwort, da es keine Synovialscheide ist der Mittelteil der Sehne bedeckt, wo die Reparatur erfolgt. Trotz dieser Einschränkungen hat dieses Modell den Vorteil der Erzeugung Bewegungsbereich beschränkende Verwachsungen, die noch in Mausmodellen, die mehr clos nachgewiesen werden muss,ely das klinische Szenario nähern. Dieses Modell wurde verwendet, Knock-out – Modelle Maus 12,13, zu bewerten und verschiedene pharmakologische Ansätze zu testen Heilung 14-17 zu verbessern. Die histologische Analysen dieses Modells, Immunhistochemie und in-situ-Hybridisierung können wichtige Einblicke in die Lokalisierung von Schlüsselgenen und Proteinen während der Heilung bieten. Jedoch stellt die Histologie nur eine Querschnitts räumliche Analyse und Quantifizierung nicht während des gesamten Gewebes ermöglichen. Flow ist Zytometrie eine quantitative Ansatz, aber nur eine sehr begrenzte Anzahl von Zellen aus der Heilungssehnengewebe im Mausmodell, isoliert werden, und diese Zahl wird weiter verringert während der Fixierung, Permeabilisierung und Waschschritte. Wenn man dies in Rechnung, um, Durchflusszytometrie eine undurchführbar Ansatz wird aufgrund der Anzahl der Tiere, die erforderlich wäre. Ein alternatives Verfahren ist notwendig, um die Mehrheit der kleinen Zellpopulation zu erhalten, umweiter zu den Heilungs milieu charakterisieren. Das verwendete Verfahren, dies zu erreichen, ist hier dargestellt, beinhaltet Konzentration der isolierten Zellen über Zentrifugation Zytologie auf einen Glasträger, gefolgt von Immunzytochemie. In der vorliegenden Studie EdU (5-Ethinyl-2'deoxyuridine, ein Thymidin-Analogon) Einbau und nachfolgende Markierung wurde verwendet, um die relativen proliferative Zustand der Zellen bei der Heilungsstelle zu bestimmen. Dieser Ansatz kann die Wirksamkeit von pharmakologischen Behandlungen auf die Zellproliferation, Gen-Knock-out oder Überexpression oder zur Identifizierung und Quantifizierung verschiedenen Zellpopulationen zu testen, angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das chirurgische Verfahren für ein Mausmodell der vollständigen Durchtrennung und die Reparatur der digitorum longus Flexor wird in dieser Studie vorgestellt. Zusätzlich wird eine neuartige Anwendung der Konzentration kleiner Zellpopulationen mit Zytologie Zentrifuge gezeigt, was eine quantitative immunocytochemische Analyse der zellulären Umgebung während der Beugesehnenheilung. Dieses Modell der Beugesehnenreparatur zeigt eine reproduzierbare Heilungsreaktion, die verwendet werden können Veränderungen in den He…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von der amerikanischen Gesellschaft für Handchirurgie Pilot-Award und NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (zu AEL) und NIAMS / NIH P30AR061307 unterstützt.
Materials
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 30G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1X PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24x50mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O’Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
