פגיעת גיד מכופף Murine וכירורגיה תיקון
Summary
גידים מכופפים ביד נפצעים נפוץ, מה שמוביל פונקצית יד לקויה. עם זאת, תגובת ריפוי צלקת הרקמות אינה מאופיינת היטב. מודל Murine של ריפוי גיד מכופף מודגם כאן. מודל זה יכול לשפר את ההבנה הכוללת של תהליך הריפוי ולהעריך גישות טיפוליות כדי לשפר את הריפוי.
Abstract
גיד מתחבר שרירים ועצמות השלד, הקלת התנועה של כמעט את כל הגוף. ביד, גידים מכופפים (FTS) לאפשר כיפוף האצבעות ותפקוד יד בכלל. פציעות FTS נפוצות, וריפוי משביע רצון לעתים קרובות נפגע בשל רקמת צלקתית עודפי הידבקויות בין גיד הרקמה שמסביב. עם זאת, מעט מאוד ידוע על הרכיבים המולקולריים התאיים של תיקון FT. לשם כך, מודל Murine של תיקון FT כי משחזר היבטים רבים של ריפוי בבני אדם, כולל מגוון לקוי של תנועה וירידה תכונות מכניות, פותחה שתואר לעיל. הנה הדגמה מעמיקה של הליך כירורגים זה מסופקת, מעורב חיתוך רוחב והתיקון הבא של longus digitorum המכופף (FDL) גיד הכף האחורית בעכברים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבצע ניתוח שושלת של תאים מסוגים שונים, להעריך את ההשפעות של רווח גן או פסד של פונקציה, וכדי לבדוק את האפיםcacy של התערבויות תרופתיות בתהליך הריפוי. עם זאת, ישנן שתי מגבלות עיקריות מודל זה: i) גיד FDL באמצע החלק של הכף האחורית בעכברים, שבו חיתוך הרוחב והתיקון להתרחש, אינו מוקף נדן סינוביאלי. לכן מודל זה אינו לוקח בחשבון את התרומה הפוטנציאלית של הנדן לתהליך היווצרות צלקת. ii) כדי להגן על היושרה של אתר התיקון, FT הוא שוחרר בצומת myotendinous, ומקטין את הכוחות המכאניים של הגיד, תורם סביר היווצרות צלקת מוגברת. בידוד של תאים מספיק מן הרקמה פרור של FT במהלך תהליך הריפוי עבור ניתוח תזרים cytometric הוכיח מאתגר; צנטריפוגה ציטולוגיה להתרכז תאים אלה היא שיטה חלופית בשימוש, ומאפשר הדור של ההכנות התא שעליו תיוג immunofluorescent יכול להתבצע. באמצעות שיטה זו, כימות של תאים או חלבונים בעלי עניין במהלך ריפוי FT הופכת אפשרית.
Introduction
גידים מכופפים בעבודת היד בתיאום עם השרירים המכופפים של אמת נדנים דיגיטליים כדי לאפשר כיפוף של הספרות ותפקוד אחיזה של היד. גידים מכופפים לרוץ לאורך היבט Palmar של היד; יחסית שטחית במיקום זה לעתים קרובות תוצאות פציעות בגידים המכופפים במהלך טראומה אל היד. גידים לרפא באמצעות תגובת צלקת רקמות ולא התחדשות של גיד נורמלי רקמות 1. בעוד רקמת צלקת זה מספקת המשכיות לגיד, פונקציה דרמטית פחת יחסית גיד בריא. מרוכבים רקמת גיד-צלקת מאופיינים תכונות מכניות לקוי 1, טיוח הגידים לתיקון סביר יותר להתפקע. בנוסף, רקמת צלקת חסרה את הארגון של מבנה סיבי קולגן גיד הילידים, וכתוצאה מכך לעלייה בגודל גיד וצובר. בהתחשב במגבלות האנטומי של יחידת-נדן הגיד, אפילו עלייה מתונה גודל גיד יכול דרסטי אדוםתחיקת פונקצית הגלישה של הגיד, ולכן טווח ספרה של תנועה ותפקוד יד.
לפני של פציעות 1960 עד הגידים המכופפים, בעיקר אלו המופיעות Zone II של היד, לא תוקנו באופן שיגרתי עקב הסיבוכים החמורים בריפוי שהתעוררו עם תיקונים אלה 2. אזור זה של היד כונה "שטח הפקר" 3. עם זאת, שיפורים בטכניקות הכירורגיות, דפוסי תפר ופרוטוקולים שיקום פיזיותרפיה השתפרו באופן דרמטי התוצאות של תיקונים גיד מכופף 2. למרות ההתפתחויות הללו, עד 40% של תיקונים לגרום להיווצרות הדבקה מספיק כדי לעכב ביד פונקציה 4. לכן, גישה ביולוגית נדרשה לשפר את הריפוי. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על תהליך ריפוי הגיד ברמה התאית ומולקולרית. לכן, המטרה הייתה לפתח מודל בעכברים שיכולים לשמש כדי לשפר את מבין מה היסודגרם של רכיבים התאיים ומולקולריים של ריפוי גיד מכופף ותגובת היווצרות הצלקת, כאמצעי לזיהוי מטרות טיפוליות חדשניות כדי לשפר את הריפוי.
גדולים יותר במודלים של בעלי חיים כבר סייעו לקדם הבנה של תהליך ריפוי הגיד המכופף. מחקרים בכלבי ארנב הוכיחו הוא את יכולת הריפוי הפנימית וחיצונית של גידים מכופפים 5,6, את החשיבות של תנועה פסיבית מבוקרת מוקדם מזעור ביחס היווצרות הידבקות לחוסר מעש 7, כמו גם את ההשפעות של דפוסי תפר שונים על תהליך הריפוי 8 , 9. בנוסף, מודל הכלבים כבר שימושי בבדיקת גישות רקמות הנדסת translational כדי לשפר את הריפוי 10. עם זאת, ישנם מספר יתרונות חשובים באמצעות קרוב משפחה במודל Murine מודל חיה גדולה, כולל בעלות היחסית, זמינות של ריאגנטים ספציפיים בעכברים, ואת הקלות של יצירת knoc העולמיk-outs או בונת מחיקה / ביטוי יתר רקמות ספציפיות. יתר על כן, את הדמיון התפקודי בין אדם ועכברים ביחס גידים מכופפים 11 מצביע על התועלת הפוטנציאלית בפיתוח מודל בעכברים.
פיתוח של מודל Murine של מחקת תיקון חיתוך רוחב ו גיד מכופף היבטים רבים של ריפוי קליני, כוללים ההיווצרות של רקמת צלקתית שופעת תכונות מכאניות לקויות. המודל המתואר כאן אינו ששחזור אמיתי של פרקטיקה קלינית עקב חיתוך רוחב של FDL בצומת myotendinous כדי להגן על האתר לתקן. יתר על כן, מודל זה אינו לוקח בחשבון את התרומה של תאי נדן סינוביאלי לתגובת הריפוי, כפי שאין נדן סינוביאלי כיסוי החלק באמצע של הגיד שבו התיקון מתרחש. למרות מגבלות אלה, מודל זה יש את היתרון של מגוון המניב של הידבקויות הגבלת תנועה, אשר טרם הוכיח במודלי Murine שיותר קלואיליי להיות קרובים ככל האפשר תרחיש הקליני. מודל זה נעשה שימוש כדי להעריך מודלים עכבר נוק-אאוט 12,13, וכדי לבחון גישות פרמקולוגיות שונות כדי לשפר את הריפוי 14-17. היסטולוגית מנתח של מודל זה, באמצעות אימונוהיסטוכימיה ו הכלאה באתרו, יכול לספק תובנות חשובות ל לוקליזציה של גנים מפתח וחלבונים במהלך הריפוי. עם זאת, היסטולוגיה מספק רק ניתוח מרחבי חתך ואינו מאפשר כימות ברחבי הרקמה כולה. Cytometry זרימה מייצגת גישה כמותית יותר, אך רק מספר מצומצם מאוד של תאים יכול להיות מבודד רקמת גיד ריפוי במודל העכבר, ומספר זה ירד עוד יותר במהלך שלבי קיבעון, permeabilization, ואת כביסה. אם תיקח את זה לחשבון, cytometry זרימה הופך גישה ישימה בשל מספר בעלי החיים אשר יידרש. שיטה חלופית יש צורך לשמר את רוב האוכלוסייה תא קטן זה כדיעוד לאפיין את סביבת הריפוי. השיטה המשמשת להשגת יעד זה, המוצג כאן, כרוך ריכוז של תאים בודדים באמצעות צנטריפוגה ציטולוגיה לשקופית זכוכית, ואחריו immunocytochemistry. במחקר הנוכחי EDU (5-ethynyl-2'deoxyuridine, אנלוגי thymidine) התאגדות התיוג הבא שמשה כדי לקבוע את מצב השגשוג היחסי של תאים באתר הריפוי. גישה זו ניתן ליישם על מנת לבחון את היעילות של טיפול תרופתי על התפשטות תאים, גני נוק-אאוט או ביטוי יתר, או לזהות ולכמת אוכלוסיות תאים שונות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך כירורגי עבור מודל Murine של חיתוך רוחב מלא ותיקון של גיד longus digitorum מכופף מוצג במחקר זה. בנוסף יישום רומן לרכז אוכלוסיות תאים קטנות עם צנטריפוגות ציטולוגיה מודגם, המאפשר ניתוח immunocytochemical כמוני של הסביבה הסלולר במהלך ריפוי גיד מכופף. מודל זה של תיקון גיד מכופף מדגים תג…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי האגודה האמריקאית לכירורגיה של פרס פיילוט יד ו- NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (כדי AEL) ו NIAMS / NIH P30AR061307.
Materials
| Surgical preparation | |||
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
| Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
| Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
| 0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 30G needle | BD | 305106 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
| 70% ethanol | |||
| Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | |||
| Portable balance 200g | Ohaus | SP202 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
| Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
| 5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
| 8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
| Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytospin method | |||
| Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
| 1X PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
| Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
| HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
| Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunocytochemistry | |||
| Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
| Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
| Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
| Glass coverslips 24x50mm #1.5 | |||
| Clear nail polish |
References
- Lin, T. Biomechanics of tendon inury and repair. J Biomech. 37, 865-877 (2004).
- Strickland, J. W. Development of flexor tendon surgery: twenty-five years of progress. J Hand Surg [Am]. 25, 214-235 (2000).
- Bunnell, S. Repair of tendons in the fingers and description of two new instruments. Surg Gynecol Obstet. 26, 103-110 (1918).
- Aydin, A., et al. Single-stage flexor tendoplasty in the treatment of flexor tendon injuries. Acta Orthop Traumatol Turc. 38, 54-59 (2004).
- Gelberman, R. H., Steinberg, D., Amiel, D., Akeson, W. Fibroblast chemotaxis after tendon repair. J Hand Surg Am. 16, 686-693 (1991).
- Lundborg, G., Rank, F. Experimental intrinsic healing of flexor tendons based upon synovial fluid nutrition. J Hand Surg Am. 3, 21-31 (1978).
- Aoki, M., Kubota, H., Pruitt, D. L., Manske, P. R. Biomechanical and histologic characteristics of canine flexor tendon repair using early postoperative mobilization. J Hand Surg Am. 22, 107-114 (1997).
- Kim, H. M., et al. Technical and biological modifications for enhanced flexor tendon repair. J Hand Surg Am. 35, 1031-1037 (2010).
- Aoki, M., Manske, P. R., Pruitt, D. L., Kubota, H., Larson, B. J. Work of flexion after flexor tendon repair according to the placement of sutures. Clin Orthop Relat Res. , 205-210 (1995).
- Zhao, C., et al. Award for Outstanding Orthopaedic Research: Engineering flexor tendon repair with lubricant, cells, and cytokines in a canine model. Clin Orthop Relat Res. 472, 2569-2578 (2014).
- Wong, J., Bennett, W., Ferguson, M. W., McGrouther, D. A. Microscopic and histological examination of the mouse hindpaw digit and flexor tendon arrangement with 3D reconstruction. J Anat. 209, 533-545 (2006).
- Katzel, E. B., et al. Impact of Smad3 loss of function on scarring and adhesion formation during tendon healing. J. Orthop. Res. 29, 684-693 (2011).
- Loiselle, A. E., et al. Bone marrow-derived matrix metalloproteinase-9 is associated with fibrous adhesion formation after murine flexor tendon injury. PloS one. 7, e40602 (2012).
- Lee, D. J., et al. Parathyroid hormone 1-34 enhances extracellular matrix deposition and organization during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 17-24 (2015).
- Geary, M. B., et al. Systemic EP4 Inhibition Increases Adhesion Formation in a Murine Model of Flexor Tendon Repair. PloS one. 10, e0136351 (2015).
- Loiselle, A. E., et al. Development of antisense oligonucleotide (ASO) technology against Tgf-beta signaling to prevent scarring during flexor tendon repair. J Orthop Res. 33, 859-866 (2015).
- Orner, C. A., Geary, M. B., Hammert, W. C., O’Keefe, R. J., Loiselle, A. E. Low-dose and short-duration Matrix Metalloproteinase 9 Inhibition does not affect adhesion formation during murine flexor tendon healing. Plast Reconstr Surg. , (2016).
- Loiselle, A. E., et al. Remodeling of murine intrasynovial tendon adhesions following injury: MMP and neotendon gene expression. J Orthop Res. 27, 833-840 (2009).
- Tsubone, T., et al. Effect of TGF-beta inducible early gene deficiency on flexor tendon healing. J Orthop Res. 24, 569-575 (2006).
- Beason, D. P., Kuntz, A. F., Hsu, J. E., Miller, K. S., Soslowsky, L. J. Development and evaluation of multiple tendon injury models in the mouse. J Biomech. 45, 1550-1553 (2012).
- David, M. A., et al. Tendon repair is compromised in a high fat diet-induced mouse model of obesity and type 2 diabetes. PloS one. 9, e91234 (2014).
- Wong, J. K., et al. The cellular biology of flexor tendon adhesion formation: an old problem in a new paradigm. Am J Pathol. 175, 1938-1951 (2009).
