Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.
Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.
En begrensning ved nåværende HIV-1-behandling er at de må være kronisk administreres for å forebygge sykdomsprogresjon. Transplantasjon av HIV-1-resistent T-lymfocytt, eller hematopoetiske stamceller, har potensial til å gi langvarig kontroll av HIV-1-replikasjon i fravær av medikamentbehandling 1,2, og kan også være en effektiv metode for å oppnå en HIV-1-kur 3. En måte å gjøre cellene resistente mot HIV-1-replikasjon, er å sette inn ett eller flere gener som koder for anti-HIV-1-RNA eller peptider til en infisert individuelle celler i løpet av en autolog transplantasjon 4. Flere kandidat anti-HIV-1-gener er blitt utformet med noen påbegynner kliniske forsøk i kombinasjoner av to 5 eller tre 6, for å forebygge utviklingen av HIV-1 resistens mot et enkelt gen.
Anti-HIV-1 RNA er blant de beste kandidatene for kombinasjon genterapi på grunn av deres lave potensial til å utløse immunrespons og fordi deer transkribert fra svært korte gensekvenser. Noen anti-HIV-1 RNA har blitt designet for å målrette viral oppføring og integrering. Men de fleste anti-HIV-1-RNA target post-integrasjonstrinn i den virale livssyklus (figur 1). Post-integrasjon hemmere inkluderer lokkefugl RNA, rettet mot HIV-1 regulatoriske proteiner Tat eller Rev 1, og antisense-baserte RNA, målretting ulike steder i HIV-1 RNA, som ribozymer 7, shRNAs 8 og U1i RNA 9. Fremgangsmåter som har blitt brukt for å sammenligne effektiviteten av anti-HIV-1-RNA omfatter overvåking av virusreplikasjon i celler transdusert med gener som koder for kandidat RNA-er og måling av virusproduksjon i celler forbigående transfektert med plasmider som uttrykker kandidat RNA-er og en HIV-1-ekspresjonsplasmid 10 -13. Vi har tidligere benyttet en HIV-1-produksjon assay for å screene HIV-1 RNA for ny ribozym målse 13-15. Disse metodene har siden blitt raffinert for å optimalisere formatet til en RNAinnblanding molekyl uttrykt fra plasmid-DNA som en shRNA eller leveres som et syntetisk siRNA 16. Analysen måler produksjon av modne virus fra humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler, og kan brukes for å sammenligne effektene av inhibitorer som er rettet mot etterintegrasjons trinn i HIV-1-replikasjonssyklus (figur 1). For hemmere som er rettet mot pre-integrasjon trinn, er alternative analyser som en TZM-bl celle smittsomhet analysen 17 for å vurdere antiviral effekt.
Store sikkerhetsproblemer for levering av anti-HIV-1 RNA i klinikken inkluderer potensielle off-target effekter på humane RNA eller proteiner, og aktivering av medfødte immun sensorer. For å evaluere toksisitet av anti-HIV-1 sirnas har vi benyttet en cellelevedyktighet analyse i forskjellige cellelinjer 16. Vi har også målt aktivering av de dobbelt-trådede RNA immun sensorer, RNA-aktivert protein kinase R (PKR) og Toll like receptor 3 (TLR3), samt expression av interferonet stimulert genet, ADAR1 p150. Disse analyser kan anvendes for å bekrefte at effekten av anti-HIV-1 RNA er ikke på grunn av indirekte effekter på celle-levedyktighet eller immun sensor aktivering. De er også nyttige i eksklusiv kandidat RNA-er med potensielle toksisitet fra videre utvikling.
I de følgende protokoller for å identifisere nye terapeutiske prosedyrer RNA og optimalisere formatet av eksisterende, er beskrevet. Metodene er nyttige for screening RNA baserte post-integrasjon hemmere av HIV-1-replikasjon og kan tilpasses til skjermen andre post-integrasjon hemmere, for eksempel små molekyler rettet mot Rev mediert eksport av viral RNA 18 eller CRISPR / Cas systemer designet for å målrette integrert HIV-1 DNA 19.
HIV-1-produksjon assayet beskrevet ble utført ved anvendelse av HEK293T celler (figur 2) og er lik assays som brukes for å screene HIV-1 RNA for effektiv ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30, og U1i RNA 11,31 målse. Ved hjelp av ulike metoder for å kvantifisere HIV-1 produksjon, har de fleste studiene målt virusproduksjon 48 timer etter ko-transfeksjon av en HIV-1 uttrykk plasmid med kandidat RNA. Etter produksjon av HIV-1, umodne viruspartiklene gjennomgår…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet presenteres her ble støttet av den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) (gir DCB-120 266, PPP-133377 og HBF-348967 til AG).
DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
[32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
ECL – Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |