Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA'lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi
Summary
Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.
Abstract
Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.
Introduction
Mevcut HIV-1 terapileri sınırlaması, kronik hastalığın ilerlemesini engellemek için de uygulanabilir olmasıdır. HIV-1 karşı T lenfosit veya hematopoietik kök hücre nakli, ilaç tedavisi 1,2 yokluğunda HIV-1 replikasyonu, uzun süreli kontrolünü sağlama potansiyeline sahiptir ve aynı zamanda, bir HIV-1 ilacı elde etmek için etkili bir yaklaşım olabilir 3.. HIV-1 replikasyonu dirençli hücre oluşturmak için bir yolu, otolog transplant 4 sırasında enfekte bireyin hücrelerine anti-HIV-1 RNA veya peptitler kodlayan bir ya da daha fazla gen eklemektir. Çeşitli aday anti-HIV-1 genlerinin herhangi bir tek genin HIV-1 direnç gelişmesini önlemek için, iki adet 5 ya da üç 6 kombinasyonları bazı giren klinik çalışmalarda dizayn edilmiştir.
Anti-HIV-1 RNA immün yanıtları ortaya çıkarmak için düşük potansiyel ve onlar için kombine gen terapisi için en iyi adaylar arasındaÇok kısa bir gen sekanslarından transkribe edilmektedir. Bazı anti-HIV-1 RNA, viral giriş ve bütünleşmesini hedeflemek üzere dizayn edilmiştir. Bununla birlikte, en anti-HIV-1 RNA, viral yaşam çevriminde sonrası entegrasyon adımlar (Şekil 1) hedefler. Sonrası entegrasyon inhibitörleri ribozimler 7, 8 ve shRNAs U1i RNA'lar 9 olarak, HİV-1 düzenleyici proteinleri tat veya rev 1 ve antisens dayalı RNA hedef HIV-1 RNA farklı sitesi hedef, yem RNA içerir. Anti-HIV-1 RNA etkinliğini karşılaştırmak için kullanılmış olan yöntemler genlerin aday RNA'lar kodlayan ve viral geçici aday RNA ifade eden plasmidler ile transfekte edilen hücrelerde üretim ve HIV-1 ifade plazmid ölçüm ile dönüştürülmüş hücrelerin viral replikasyonu izlenmesini, 10 -13. Daha önce yeni bir ribozim, hedef siteye 13-15 HIV-1 RNA taranması için bir HIV-1 üretimi deneyi kullandık. Bu yöntemler beri bir RNA biçimini optimize etmek için rafine edilmişgirişim molekülü, bir shRNA plazmid DNA'sından ifade edilen ya da sentetik bir siRNA 16 olarak verilir. Deney insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerinde olgun virüs üretimini ölçer ve (Şekil 1), HIV-1 replikasyon döngüsünde sonrası entegrasyon evreleri hedefleyen önleyicilerinin etkilerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Ön entegrasyon basamakları hedefleyen inhibitörleri, böyle bir tzm-bl hücre enfektivite tahlil 17 gibi alternatif deneyler antiviral etkinliğini değerlendirmek için gereklidir.
Klinikte anti-HIV-1 RNA teslimi için önemli güvenlik kaygıları, insan RNA veya protein ve doğuştan gelen bağışıklık sensör aktivasyonu üzerindeki potansiyel hedef dışı etkiler bulunmaktadır. Anti-HIV-1 siRNA'lar toksisitesini değerlendirmek için, farklı hücre hatları 16 bir hücre canlılığı deneyi kullandık. Ayrıca, iki iplikçikli bir RNA bağışıklık sensörler aktivasyonu ölçülmüştür RNA aktive edilmiş protein kinaz R (PKR) reseptör 3 (TLR3) Toll benzeri gibi exinterferon pression geni ADAR1 P150 uyarılmış. Bu deneyler, anti-HIV-1 RNA etkinliği hücre canlılığı veya immün sensör aktivasyon dolaylı etkileri nedeniyle olmadığını teyit etmek için kullanılabilir. Ayrıca, daha da geliştirilmesi, potansiyel toksisite aday RNA'ların hariç yararlıdır.
Aşağıdaki protokollerde, prosedürler yeni tedavi RNA'lar belirlemek ve mevcut biçimi açıklanmıştır optimize etmek. Yöntemleri, HIV-1 replikasyonu tarama RNA temelli sonrası entegrasyon inhibitörleri için faydalı olan ve bu tür viral RNA 18 ya da CRISPR Rev aracılı ihracat hedefleme küçük moleküller gibi diğer sonrası entegrasyon inhibitörlerinin taranması için adapte edilebilir / tasarlanan Cas sistemleri entegre hedef HIV-1 DNA'sı 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanımlanan HIV-1 üretimi deneyi HEK293T hücreleri (Şekil 2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve etkili bir ribozim 13 shRNA 10,29, siRNA 30 ve U1i RNA 11,31 hedef sitesi HIV-1 RNA taramak için kullanılan deneyler benzer edildi. HIV-1 üretimini ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılarak, çalışmaların çoğu, aday RNA'lar ile bir HIV-1 ifade plazmidinin Müşterek transfeksiyon sonrasında, virüs üretimini 48 saat ölçtük. HIV-1 ü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada sunulan çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (DCB-120266, PPP-133377 ve AG için HBF-348967 verir).
Materials
| DMEM HyClone | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| FBS HyClone | GE Healthcare | SH30396.03 | |
| Penicillin/Streptomycin Gibco | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. | Corning | 353075, 353047, 353043 | |
| Micro tubes Axygen | Corning | 311-08-051 | |
| Low molecular weight Poly I:C | InvivoGen | 3182-29-6 | |
| DharmaFECT-1 | Dharmacon | T-2001-01 | transfection reagent for synthetic RNAs |
| TransIT-LT1 | Mirus | MIR 2300 | transfection reagent for RNA expression plasmids |
| Nonidet P40 (NP-40) | USB | 19628 | |
| [32P]dTTP | Perkin Elmer | BLU505H | |
| poly(A) RNA template | Sigma-Aldrich | 10108626001 | |
| oligo(dT)12-18 DNA primer | Thermo Fisher | 18418-012 | |
| DEAE filtermat paper | Perkin Elmer | 1450-522 | |
| Microplate scintillation counter | Perkin Elmer | 1450-024 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M-2128 | |
| DPBS HyClone | GE Healthcare | SH30028.02 | |
| Microplate spectrophotometer | Bio-rad | 1706930 | |
| Lysis buffer tablets | Roche | 4693159001, 4906837001 | protease and phosphatase inhibitors |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Bradford reagent | Bio-rad | 500-0006 | |
| Gel running chamber | Hoefer | SE600 | |
| Semi-dry transfer cell | Bio-rad | 1703940 | |
| Protein ladder EZ-Run | Thermo Fisher | BP3603-500 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 162-0094 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-1006 | |
| Antibody stripping solution | Millipore | 2504 | |
| ECL – Pierce | Thermo Fisher | PI32106 | |
| ADAR1 antibody | from Dr. B.L. Bass | ||
| phospho-T446-PKR antibody | Abcam | ab32036 | |
| phospho-S396-IRF3 antibody | Cell Signaling | 4947 | |
| PKR antibody | from Dr. A. Hovanessian | ||
| IRF3 antibody | Cell Signaling | 11904 | |
| Actin antibody | Millipore | MAB1501 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-rabbit | KPL | 474-1506 | |
| Peroxidase-labeled goat anti-mouse | KPL | 474-1806 | |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | 6226-79-5 |
References
- Hoxie, J. A., June, C. H. Novel cell and gene therapies for HIV. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a007179 (2012).
- Bobbin, M. L., Burnett, J. C., Rossi, J. J. RNA interference approaches for treatment of HIV-1 infection. Genome Med. 7, 50 (2015).
- Allers, K., et al. Evidence for the cure of HIV infection by CCR5Delta32/Delta32 stem cell transplantation. Blood. 117, 2791-2799 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. Development of hematopoietic stem cell based gene therapy for HIV-1 infection: considerations for proof of concept studies and translation to standard medical practice. Viruses. 5, 2898-2919 (2013).
- Burke, B. P., et al. Engineering Cellular Resistance to HIV-1 Infection In Vivo Using a Dual Therapeutic Lentiviral Vector. Mol Ther Nucleic Acids. 4, e236 (2015).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Sci Transl Med. 2, 36ra43 (2010).
- Scarborough, R. J., Gatignol, A. HIV and Ribozymes. Adv Exp Med Biol. 848, 97-116 (2015).
- Eekels, J. J., Berkhout, B. Toward a durable treatment of HIV-1 infection using RNA interference. Prog Mol Biol Transl Sci. 102, 141-163 (2011).
- Blazquez, L., Fortes, P. U1 interference (U1i) for Antiviral Approaches. Adv Exp Med Biol. 848, 51-69 (2015).
- McIntyre, G. J., et al. 96 shRNAs designed for maximal coverage of HIV-1 variants. Retrovirology. 6, 55 (2009).
- Sajic, R., et al. Use of modified U1 snRNAs to inhibit HIV-1 replication. Nucleic Acids Res. 35, 247-255 (2007).
- Low, J. T., et al. SHAPE-directed discovery of potent shRNA inhibitors of HIV-1. Mol Ther. 20, 820-828 (2012).
- Scarborough, R. J., et al. A Conserved Target Site in HIV-1 Gag RNA is Accessible to Inhibition by Both an HDV Ribozyme and a Short Hairpin RNA. Mol Ther Nucleic Acids. 3, e178 (2014).
- Lainé, S., et al. In vitro and in vivo cleavage of HIV-1 RNA by new SOFA-HDV ribozymes and their potential to inhibit viral replication. RNA Biol. 8, 343-353 (2011).
- Scarborough, R. J., Lévesque, M. V., Perreault, J. P., Gatignol, A. Design and Evaluation of Clinically Relevant SOFA-HDV Ribozymes Targeting HIV RNA. Methods Mol Biol. 1103, 31-43 (2014).
- Scarborough, R. J., Adams, K. L., Daher, A., Gatignol, A. Effective Inhibition of HIV-1 Production by Short Hairpin RNAs and Small Interfering RNAs Targeting a Highly Conserved Site in HIV-1 Gag RNA Is Optimized by Evaluating Alternative Length Formats. Antimicrob Agents Chemother. 59, 5297-5305 (2015).
- Sarzotti-Kelsoe, M., et al. Optimization and validation of the TZM-bl assay for standardized assessments of neutralizing antibodies against HIV-1. J Immunol Methods. 409, 131-146 (2014).
- Campos, N., et al. Long lasting control of viral rebound with a new drug ABX464 targeting Rev – mediated viral RNA biogenesis. Retrovirology. 12, 1-15 (2015).
- Zhu, W., et al. The CRISPR/Cas9 system inactivates latent HIV-1 proviral DNA. Retrovirology. 12, 22 (2015).
- Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J Virol. 76, 1004-1014 (2002).
- Shan, L., et al. A novel PCR assay for quantification of HIV-1 RNA. J Virol. 87, 6521-6525 (2013).
- Clerzius, G., et al. The PKR activator, PACT, becomes a PKR inhibitor during HIV-1 replication. Retrovirology. 10, 96 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Battisti, P. L., et al. Additive activity between the trans-activation response RNA-binding protein, TRBP2, and cyclin T1 on HIV type 1 expression and viral production in murine cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 19, 767-778 (2003).
- Bannwarth, S., et al. Cell-specific regulation of TRBP1 promoter by NF-Y transcription factor in lymphocytes and astrocytes. J Mol Biol. 355, 898-910 (2006).
- Clerzius, G., et al. ADAR1 interacts with PKR during human immunodeficiency virus infection of lymphocytes and contributes to viral replication. J Virol. 83, 10119-10128 (2009).
- Burugu, S., Daher, A., Meurs, E. F., Gatignol, A. HIV-1 translation and its regulation by cellular factors PKR and PACT. Virus Res. 193, 65-77 (2014).
- ter Brake, O., Konstantinova, P., Ceylan, M., Berkhout, B. Silencing of HIV-1 with RNA interference: a multiple shRNA approach. Mol Ther. 14, 883-892 (2006).
- Naito, Y., et al. Optimal design and validation of antiviral siRNA for targeting HIV-1. Retrovirology. 4, 80 (2007).
- Mandal, D., Feng, Z., Stoltzfus, C. M. Excessive RNA splicing and inhibition of HIV-1 replication induced by modified U1 small nuclear RNAs. J Virol. 84, 12790-12800 (2010).
- Chang, Z., et al. Enhanced expression and HIV-1 inhibition of chimeric tRNA(Lys3)-ribozymes under dual U6 snRNA and tRNA promoters. Mol Ther. 6, 481-489 (2002).
- Chang, L. J., Liu, X., He, J. Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133-1144 (2005).
- Daniels, S. M., et al. HIV-1 RRE RNA acts as an RNA silencing suppressor by competing with TRBP-bound siRNAs. RNA Biol. 12, 123-135 (2015).
- Castanotto, D., et al. Combinatorial delivery of small interfering RNAs reduces RNAi efficacy by selective incorporation into RISC. Nucleic Acids Res. 35, 5154-5164 (2007).
- Vickers, T. A., Sabripour, M., Crooke, S. T. U1 adaptors result in reduction of multiple pre-mRNA species principally by sequestering U1snRNP. Nucleic Acids Res. 39, e71 (2011).
- Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J Vis Exp. , (2015).
- Riss, T. L., et al., Sittampalam, G. S., et al. . Assay Guidance Manual. , (2004).
- Reynolds, A., et al. Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent. Rna. 12, 988-993 (2006).
- Whitehead, K. A., Dahlman, J. E., Langer, R. S., Anderson, D. G. Silencing or stimulation? siRNA delivery and the immune system. Annu Rev Chem Biomol Eng. 2, 77-96 (2011).
