Die Herstellung von Oblique Spinal Cord Slices für Ventralwurzel Stimulation
Summary
Wir zeigen, wie schräge Scheiben des Rückenmarks in jungen Mäusen vorzubereiten. Diese Herstellung ermöglicht die Stimulation der ventralen Wurzeln.
Abstract
Elektrophysiologische Aufnahmen von Rückenmark Scheiben haben sich als wertvolle Technik zu sein, ein breites Spektrum von Fragen zu untersuchen, die von Mobilnetzwerkeigenschaften. Wir zeigen, wie rentabel schräge Scheiben des Rückenmarks von jungen Mäusen herzustellen (P2 – P11). Bei dieser Herstellung behalten die Motoneuronen ihre Axone von den ventralen Wurzel des Rückenmarks kommen aus. Die Stimulation dieser Axone entlockt zurück ausbreitenden Aktionspotentiale der Motoneuron somas und spannend die Motoneuron Kollateralen im Rückenmark eindringen. Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale ist eine sofortige, endgültige und elegante Art und Weise Motoneuron Identität zu charakterisieren, die andere Methoden Identifizierung übertrifft. Darüber hinaus ist die Motoneuron Kollateralen stimulierenden eine einfache und sichere Weg, um die Sicherheit Ziele der Motoneuronen im Rückenmark, wie andere Motoneuronen oder R zu erregenenshaw Zellen. In diesem Protokoll stellen wir antidrome Aufnahmen von der Motoneuron somas sowie Renshaw Zellanregung aus ventral root Stimulation.
Introduction
Historisch gesehen , in vivo an großen Tieren wie Katzen oder Ratten Motoneuron Aufnahmen scharf Elektrode 1 wurden durchgeführt , oder auf einem isolierten ganzen Rückenmark in Mäuse 2. Die Entstehung der Patch-Clamp-Aufnahmetechnik in den 1980er Jahren für den direkten Zugriff auf das Motoneuron genannt somas nach Bedarf Abdichtung unter Sichtführung erreicht werden. Somit wurde das Rückenmark slice Zubereitung leicht seit den frühen 1990ern 3 erreicht. Jedoch oft früh slice Zubereitung nicht für die Stimulation der ventralen Wurzeln ermöglichen. Nach bestem Wissen und Gewissen, haben nur zwei Studien erfolgreich Stimulation der ventralen Wurzeln in Querschnitten berichtet, und keiner wurde von den Mäusen 4,5 erhalten.
In diesem Artikel stellen wir eine Technik tragfähige Rückenmarksscheiben neugeborenen Mäusen zu erreichen (P2 – P11) in dem die Motoneuron-Pool seiner ventralen Wurzel abzuweichen Axone beibehält. auslassenral Wurzel Stimulation löst antidromic Aktionspotential aus dem gleichen Ventralwurzel zurück in die Somen des Motoneuron-Pool zu verlassen. Es regt auch die Motoneuron Sicherheiten Ziele, andere Motoneuronen 6-10 und die Renshaw – Zellen 11-13. Da nur Motoneurone ihre Axone die ventralen Wurzeln nach unten senden, verwenden wir die Aufnahme von antidromic Aktionspotentiale als eine einfache und sichere Weg um physiologicaly Motoneuronen 10 identifizieren.
Neben der Verwendung von potenziell nicht-inclusive oder irreführende elektrophysiologischen und morphologischen Kriterien , um die Motoneuron Identität, die jüngsten Studien über Rückenmark Motoneurone zu bestätigen stützen sich ebenfalls auf mühsame und zeitraubende Post – hoc – Anfärbungen 16. Eine solche Identifizierung wird in der Regel nur durchgeführt mit einer Probe der aufgezeichneten Zellen. Andere Identifikationsstrategien setzen auf Mauslinien, in denen die Motoneurone endogene Fluoreszenz exprimieren <sup> 17-19. Doch bereits in jungen Jahren mit genetisch kodierten Markierungen kann schwierig sein, wenn Markerexpression noch variabel ist oder wenn die Studie erfordert bereits eine transgene Mauslinie verwendet wird. Alternativ kann antidrome Aktionspotentialaufzeichnungen routinemäßig auf allen Mäusen vom Beginn der Zellaufnahme erfolgen. Experimentatoren arbeiten an intakten Rückenmark Vorbereitungen bei der Katze, Ratte und Maus haben zuverlässig solche Identifikationstechniken seit den 1950er Jahren 1,2,20,21 verwendet. Bei optimalen Bedingungen konnten wir antidromic Aktionspotentiale aus praktisch alle aufgenommenen Motoneurone zu entlocken.
Darüber hinaus können Ventralwurzel Stimulation verwendet werden , um zuverlässig andere Motoneurone 22,23 oder ihre Ziele begeistern. die Renshaw Zellen 10,24,25. Wir präsentieren hier Anwendungen der Ventralwurzel Stimulation in Form von antidromic Aktionspotential Aufnahmen von Motoneuron somas sowie Anregung von Renshaw Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oblique slicing des Rückenmarks ist wichtig, da es für die einseitige Stimulation der Motoneuron-Pools und Renshaw Zellen in einer einzigen Wirbelsegments in einer zuverlässigen, umfassende und spezifische Weise ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht es eine schnelle, elegante und eindeutige Identifikation von aufgezeichnetem Motoneurone. Als nächstes werden wir die Vorteile dieser Technik im Vergleich zu anderen Scheibe Zubereitungsmethoden zu markieren, und dann werden wir die häufigsten Fallen stressen zu verm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Marin Manuel und Olivia Goldman-Szwajkajzer für ihre Hilfe in den Fotos zu machen. Die Autoren danken auch Arjun Masukar und Tobias Bock für das Manuskript Korrektur. Finanzielle Unterstützungen wurden von der Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401) zur Verfügung gestellt, das NIH-NINDS (R01NS077863), die Thierry Latran Foundation (OHEX Project), die Französisch Verband für Myopathie ( Grant-Nummer 16026) und Target ALS sind dankbar anerkannt. Felix Leroy war der Empfänger einer "Contrat Doctoral" von der Ecole Normale Supérieure, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
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