Ventral Kök Stimulation için eğik Omurilik Dilimleri hazırlanması
Summary
Biz genç farelerde omurilik eğik dilim nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Bu preparat, ventral köklerin uyarılması için izin verir.
Abstract
omurilik dilimleri gelen elektrofizyolojik kayıtlar ağ özelliklerine hücresel soruları geniş bir yelpazede araştırmak için değerli bir tekniktir olduğu kanıtlanmıştır. Biz genç farelerde (- P11 P2) spinal kord canlı eğik dilim nasıl hazırlanacağını göstermektedir. Bu hazırlıkta, motor nöronlar aksonları omuriliğin ventral köklerin çıkan korur. Bu akson uyarılması omurilik içinde motornöron Somas ve heyecan verici motor nöron teminatlar istila geri yayılan aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarır. antidromik aksiyon potansiyellerinin kaydedilmesi diğer kimlik yöntemlerini aşan motonöron kimliğini, karakterize ivedi, kesin ve zarif bir yoldur. Ayrıca, motor nöron teminatları uyarıcı gibi diğer motor nöronlar veya R omurilik içindeki motor nöronlar teminat hedeflerini, heyecanlandırmak için basit ve güvenilir bir yoldurhücreleri enshaw. Bu protokol, ventral kök uyarılmasından kaynaklanan, motor nöron Somas olarak Renshaw hücre uyarma gelen antidromik kayıtları sunuyoruz.
Introduction
Tarihsel olarak, keskin elektrodu kullanılarak motonöron kayıtları kedi, sıçan 1 ya da fareler 2 izole edilmiş bir bütün omurilik büyük hayvanlarda in vivo olarak gerçekleştirilmiştir. somas gerekli sızdırmazlık olarak motor nöron doğrudan erişim için çağrıda 1980'li yıllarda patch-kelepçe kayıt tekniğinin ortaya çıkması, görsel rehberliği altında elde edilecek. Böylece, omurilik dilim hazırlık kolayca 1990'ların başından bu yana 3 elde edilmiştir. Ancak, erken dilim hazırlık genellikle ventral köklerinin uyarılması için izin vermedi. Bizim bildiğimiz kadarıyla, sadece iki çalışma enine dilim ventral köklerin başarılı uyarılması bildirilmiştir ve hiçbiri fareler 4,5 elde edilmiştir.
motonöron havuzu ventral kök kalkan aksonlar elinde bulundurduğu – (P11 P2) Bu yazıda yenidoğan farelerin canlı omurilik dilim elde etmek için bir teknik sunuyoruz. delikral kök stimülasyon aynı ventral kök çıkan motonöron havuz mis geri antidromik aksiyon potansiyelini tetikler. Aynı zamanda motor nöron teminat hedefleri, diğer motor nöronlar 6-10 ve Renshaw hücreleri 11-13 heyecanlandırıyor. Sadece motor nöronlar ventral kökleri kendi aksonlar aşağı göndermek yana, motor nöronlar 10 belirlemek physiologicaly için basit ve kesin yolu olarak antidromik aksiyon potansiyelleri kayıt kullanın.
Motonöron kimliğini doğrulamak için potansiyel olmayan kapsayıcı veya yanıltıcı elektrofizyolojik ve morfolojik kriterler kullanılarak ek olarak, omurilik motor nöronlar üzerinde son çalışmalar da post hoc sıkıcı ve zaman alıcı Renklendirmeler 16 dayanmıştır. Bu tanımlama genellikle kaydedilen bir hücre numunesi üzerinde gerçekleştirilmiştir. Diğer kimlik stratejileri motor nöronlar endojen floresan ifade ettiği fare hatları güveniyor <sup> 17-19. Çalışma zaten transgenik fare hattı kullanarak gerektiriyorsa işaretleyici ifade hala değişken veya Ancak, genetik olarak kodlanmış işaretlerini kullanarak genç yaşta zor olabilir. Seçenek olarak ise, antidromik aksiyon potansiyeli kayıtları hücre kayıt başlangıcından itibaren tüm fareler üzerinde rutin olarak gerçekleştirilebilir. Kedi, sıçan ve fare bozulmamış omurilik hazırlıkları üzerinde çalışan deneyci, güvenilir 1950 1,2,20,21 beri böyle tanımlama teknikleri kullandık. Optimal koşullarda, biz kaydedilen motor nöronlar neredeyse tüm antidromik aksiyon potansiyelleri ortaya çıkarmak için başardık.
Ayrıca, ventral kök stimülasyon güvenilir diğer motor nöronlar 22,23 ya da hedef uyarmak için kullanılabilir. Renshaw hücreleri 10,24,25. Burada motonöron mis gelen antidromik aksiyon potansiyeli kayıtlarında şeklinde ventral kök stimülasyon uygulamaları yanı sıra, Renshaw hücre uyarma sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir, güvenilir, kapsamlı ve belirli bir şekilde tek bir omurga segmentinde motornöron havuzları ve Renshaw hücreleri tek taraflı uyarılması için izin verir çünkü omurilik eğik dilimleme önemlidir. Ayrıca, kaydedilen motor nöronlar, hızlı, zarif ve olmayan belirsiz tanımlanmasına izin verir. Sonra, diğer dilim hazırlama yöntemlerine göre bu tekniğin avantajlarını vurgulamak olacaktır, ve sonra biz bu yordamı gerçekleştirirken önlemek için en yaygın tuzaklar stres olacak.
<p class="j…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar fotoğraf çekmek onların yardım için Marin Manuel ve Olivia Goldman-Szwajkajzer teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca yazının redaksiyon için Arjun Masukar ve Tobias Bock teşekkür ederiz. Mali destekler la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401) dökün Agence Nationale tarafından sağlanan, NIH-NINDS (R01NS077863), Thierry Latrán Vakfı (OHEX Projesi), miyopati Fransız derneği ( hibe sayısı 16026) ve Hedef ALS minnetle kabul vardır. Felix Leroy Ecole Normale Supérieure Cachan'da bir "contrat Doktora" layık görüldü.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
References
- Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation. J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).
- Bories, C., Amendola, J., Lamotte d’Incamps, B., Durand, J. Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).
- Takahashi, T. Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord. J Physiol. 423, 27-46 (1990).
- Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices. J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).
- Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O’Donovan, M. J. Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo. PLoS One. 2 (5), e417 (2007).
- Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat. Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).
- Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase. Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).
- Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat. J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).
- Ichinose, T., Miyata, Y. Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording. Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse. J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).
- Renshaw, B. Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots. J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).
- Renshaw, B. Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition. Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).
- Renshaw, B. Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition). Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).
- Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice. J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).
- Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).
- Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).
- Hadzipasic, M., et al. Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
- Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo. J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, (2014).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Zytnicki, D. Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice. J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).
- Lamotte d’Incamps, B., Ascher, P. Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).
- Lamotte d’Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse. J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).
- Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).
- Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O’Donovan, M. J., Alvarez, F. J. Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells. J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).
- Perry, S., et al. Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK. Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).
- Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices. J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).
- Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat. J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).
- Cooper, S., Sherington, C. S. Gower’s tract and spinal border cells. Brain. 63, 123-124 (1940).
- Morin, F., Schwartz, H. G., O’Leary, J. L. Experimental study of the spinothalamic and related tracts. Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).
- Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse. Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).
- Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons. J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).
- Dourado, M., Sargent, P. B. Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord). J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).
- Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. The role of specific ions in glutamate neurotoxicity. Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).
