La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación
Summary
Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.
Abstract
Registros electrofisiológicos de láminas de médula espinal han demostrado ser una técnica valiosa para investigar una amplia gama de preguntas, de celular a las propiedades de red. Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas viables de la médula espinal de ratones jóvenes (P2 – P11). En esta preparación, las motoneuronas conservan sus axones que sale de las raíces ventrales de la médula espinal. La estimulación de estos axones provoca back-propagan los potenciales de acción que invaden el somas de las neuronas motoras y emocionantes colaterales el motoneuronas en la médula espinal. Grabación de potenciales de acción antidrómicos es una forma inmediata, definitiva y elegante para caracterizar la identidad de las neuronas motoras, que supera a otros métodos de identificación. Además, la estimulación de las neuronas motoras colaterales es una manera simple y fiable para excitar los objetivos colaterales de las neuronas motoras en la médula espinal, tales como otros motoneuronas o Renshaw células. En este protocolo, se presentan grabaciones antidrómicos de la motoneurona somas, así como excitación de la célula de Renshaw, resultante de la estimulación de la raíz ventral.
Introduction
Históricamente, las grabaciones motoneuronas utilizando Sharp-electrodo se llevaron a cabo in vivo en animales grandes tales como gatos o ratas 1 o en una médula espinal enteros aislados en ratones 2. La aparición de la técnica de grabación de patch-clamp durante la década de 1980, llamado por el acceso directo a la motoneurona somas como el sellado necesario para conseguir bajo control visual. Por lo tanto, la preparación de la rebanada de la médula espinal se ha logrado fácilmente desde principios de 1990 3. Sin embargo, rebanada preparación temprana a menudo no permitía la estimulación de las raíces ventrales. A lo mejor de nuestro conocimiento, sólo dos estudios han informado de la estimulación exitosa de las raíces ventrales en rodajas transversales, y ninguno se obtuvo a partir de ratones 4,5.
En este artículo se presenta una técnica para lograr las rebanadas de la médula espinal viables de ratones recién nacidos (P2 – P11) en el que la piscina de motoneuronas conserva sus raíces ventrales saliendo axones. Respiraderoestimulación de la raíz ral desencadena potencial de acción antidrómica de nuevo en los somas de las neuronas motoras de la piscina que sale de la misma raíz ventral. También excita los objetivos colaterales de neuronas motoras, otras motoneuronas 6-10 y las células de Renshaw 11-13. Dado que sólo motoneuronas envían sus axones hacia abajo las raíces ventrales, se utiliza el registro de los potenciales de acción antidrómicos como una forma sencilla y definitiva a physiologicaly identificar motoneuronas 10.
Además de utilizar criterios electrofisiológicos y morfológicos potencialmente no incluido o engañosas para confirmar la identidad de las neuronas motoras, estudios recientes sobre las neuronas motoras de la médula espinal también se basó en tinciones tedioso y requiere mucho tiempo post hoc 16. Tal identificación se realiza generalmente sólo en una muestra de las células grabadas. Otras estrategias de identificación se basan en las líneas de ratón en el que las motoneuronas expresan la fluorescencia endógena <sup> 17-19. Sin embargo, el uso de marcadores codificados genéticamente puede ser difícil a una edad temprana, cuando la expresión del marcador sigue siendo variable o si el estudio ya se requiere el uso de una línea de ratones transgénicos. Alternativamente, la acción antidrómica potenciales grabaciones se pueden realizar de forma rutinaria en todos los ratones desde el inicio de la grabación de la célula. Los experimentadores que trabajan en los preparativos de la médula espinal intacta en el gato, la rata y el ratón, se han utilizado de forma fiable estas técnicas de identificación desde la década de 1950 1,2,20,21. En condiciones óptimas, hemos sido capaces de provocar potenciales de acción antidrómicos de virtualmente todas las neuronas motoras registradas.
Además, la estimulación de la raíz ventral se puede utilizar para excitar de forma fiable otros motoneuronas 22,23 o sus objetivos. las células de Renshaw 10,24,25. Presentamos aquí las aplicaciones de la estimulación de la raíz ventral en forma de acción antidrómica posibles grabaciones de somas de las neuronas motoras, así como la excitación de las células de Renshaw.
Protocol
Representative Results
Discussion
rebanar oblicua de la médula espinal es importante ya que permite la estimulación unilateral de piscinas de neuronas motoras y las células de Renshaw en un solo segmento vertebral de una manera fiable, completa y específica. Además, se permite una identificación rápida, elegante y no ambigua de las motoneuronas grabados. A continuación, vamos a destacar las ventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de preparación rebanada, y luego vamos a insistir en las trampas más comunes a evitar al reali…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Marin Manuel y Olivia Goldman-Szwajkajzer por su ayuda en la toma de las fotografías. Los autores también agradecen a Arjun Masukar y Tobias Bock para la corrección del manuscrito. Ayudas económicas fueron proporcionados por la Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429/01), el NIH NINDS (R01NS077863), la Fundación Latran Thierry (OHEX Proyecto), la Asociación Francesa de miopatía ( la subvención número 16026) y Target ALS se agradece. Felix Leroy era el destinatario de un "Contrato de Doctorado" de la Escuela Normal Superior, Cachan.
Materials
| Na-kynurenate | ABCAM | ab120256 | dissolves better then other brands |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| NaH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| sucrose | Sigma | S9378 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | G Biosciences | R040 | |
| MgCl2 | Quality Biological | 351-033-721 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Na-pyruvate | Sigma | P2250 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Agar | Sigma | A9799 | |
| QX-314 | Alomone | Q150 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Na-GTP | Sigma | 51120 | |
| gluconic acid | Sigma | G1951 | |
| Cesium hydroxide solution | Sigma | 232041 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Vannas Spring Scissors – 2.5mm | FST | 15000-08 | only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones |
| Stimulator | A-M Systems | Isolated Pulse Stimulator Model 2100 | |
| Vibratome | Campden | Vibrating Microtome 7000 – Model 7000smz-2 | |
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